2.8.1. Marcação metabólica
O teste foi conduzido em garrafas de cultura de 75 cm2, iniciando com parasitemia de 10% de esquizontes (42 – 48 horas). Foram testados dois derivados de hidroxi-naftoquinonas (4a e 4c) sendo as concentrações utilizadas de 6,5 µM e 3,75 µM, respectivamente, correspondendo a 80% dos IC50 a fim de que haja inibição da via dos isoprenóides, porém
mantendo parasitos suficientes para a detecção dos produtos e análise dos resultados. Uma terceira garrafa foi mantida sem tratamento, sendo o controle positivo. Os compostos diluídos em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) suplementado com 0.5% Albumax I (Gibco) foram adicionados às garrafas de cultura e estas foram mantidas em condições padrão a 37 °C com atmosfera de 5% de CO2. Após 24 horas, foi realizado esfregaço sanguíneo para observação
da parasitemia e avaliação do estágio evolutivo do Plasmodium, devendo estar na forma de trofozoíto (entre 14 e 22 horas após a liberação dos merozoítos). Novo meio de cultura com os compostos foi adicionado e as garrafas retornaram às condições padrão de incubação. Após 12 horas, com os parasitos no estágio de trofozoíto maduro (entre 26 e 34 horas após a liberação dos merozoítos), foi adicionado à cultura 15 µL de [1-(n)-3H]GGPP (3,125 µCi / mL) e as garrafas retornaram às condições padrão de cultivo (D’ALEXANDRI et al., 2006). Os testes foram realizados em triplicata e repetidos em três ensaios independentes.
2.8.2. Separação das formas maduras em coluna magnética
Entre 12 e 16 horas após a marcação metabólica, as formas maduras (esquizontes entre 42 – 46 horas) do parasito foram separadas utilizando uma coluna de separação magnética (MACS Separation Columns “CS”, Miltenyi Biotec) (APÊNCIDE A). As colunas foram pré-equilibradas pela eluição de 100 mL de PBS 1X, à temperatura ambiente. Para a purificação dos esquizontes, as culturas foram centrifugadas a 2.000 rpm por 5 minutos e os precipitados foram ressuspendidos em 10 mL de meio RPMI suplementado com 0.5% Albumax I (Gibco) (MATA-CANTERO et al., 2014). As culturas foram eluídas pelas colunas
em baixa velocidade (0,5 mL / min), onde só as hemácias contendo esquizontes ficam retidas, pois contém espécies de ferro paramagnéticas em relação ao meio de cultura usado para o fracionamento, enquanto que as hemácias oxigenadas são diamagnéticas, sofrendo eluição pela coluna (HACKETT et al., 2009). Os eluentes contendo hemácias não infectadas e hemácias infectadas com trofozoítos jovens foram descartados. As colunas foram lavadas com 50 mL de PBS 1X, até o eluente sair límpido, em fluxo contínuo. A coluna foi removida da unidade magnética e o conteúdo foi eluído para um tubo de fundo cônico pela adição de 30 mL de PBS 1X para a aquisição das formas maduras. Este foi centrifugado por 2000 rpm durante 5 minutos e o volume do precipitado foi ajustado para que todas as amostras ficassem com o mesmo volume (MATA-CANTERO et al., 2014). Foram feitos esfregaços sanguíneos para verificação da eficácia da purificação e homogeneidade das amostras (APÊNDICE B). Os precipitados foram transferidos para um tubo criogênico e foram estocados em N2 líquido
durante 1 hora. Posteriormente, as amostras foram liofilizadas para a extração dos parasitos. Os testes foram realizados em triplicata e repetidos em três ensaios independentes.
2.8.3. Extração da menaquinona, filoquinona e tocoferol
A menaquinona (MQ) e filoquinona (PhQ), formas da vitamina K e o α-tocoferol (TC), forma da vitamina E, sintetizadas na via do Chiquimato foram extraídas por um protocolo que extrai as três formas simultaneamente, conforme descrito a seguir. Os parasitos liofilizados foram ressuspendidos em 2 mL de ácido perclórico 0,2 M gelado em metanol, que causa o rompimento das hemácias, seguido da adição de 2 mL de éter de petróleo e agitação em vórtex por 1 minuto. As amostras foram centrifugadas a 2000 rpm/10 minutos a 15ºC, o sobrenadante foi reservado em outro tubo e o éter de petróleo foi adicionado mais duas vezes ao precipitado, seguindo o passo de centrifugação. Os sobrenadantes provenientes das lavagens foram secos em pressão de nitrogênio, ressuspendidos em 300 µL de solvente metanol/etanol (1:1 v/v) contendo os padrões para MQ, PhQ e TC e, posteriormente foram filtrados em membrana de 0,22 µm. O extrato final foi injetado no RP-HPLC (GABRIEL, 2010). O teste foi realizado em triplicata e repetido em três ensaios independentes.
2.8.4. Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) Os extratos foram analisados em um sistema isocrático com coluna Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4.6 mm x 5 µm) (Phenomenex, CA, USA), como fase estacionária, com
pré-coluna, um detector UV Gilson 152/UV-visível e um coletor de frações FC203B. O software utilizado para o processamento dos dados foi o Unipointtm LC 3.0 System Software. As frações foram coletadas em intervalos de 1 minutos em um sistema com fase móvel de metanol/etanol (50:50 v/v), fluxo de 0,5 mL / min, cuja detecção foi realizada pelo espectro de absorção UV em comprimento de onda de 270 nm (BEKKER et al., 2007). As frações radioativas foram secas por evaporação em estufa, ressuspendidas em 600 µL líquido de cintilação (Perkin Elmer, Turku, Finland) e a radioatividade foi quantificada em contagens por minuto (c.p.m.) (Beckman LS 5000 TB, CA, USA). O teste foi realizado em triplicata e repetido três vezes.
2.9. MODELAMENTO DA OPPs E DOCKING
2.9.1. Análise da sequência e alinhamento
A sequência proteica da proteína octaprenil pirofosfato sintase (OPPs) de
Plasmodium falciparum (NCBI Reference Sequence: XP_001349541.1) foi retirada da base
de dados do NCBI Genpept (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). O algoritimo BLAST contra o banco de dados de proteínas (PDB) foi usando para pesquisar as sequências homólogas. A sequência e a estrutura 3D da proteína template foi extraída da base de dados PDB (http://www.rcsb.org/pdb). O alinhamento múltiplo das sequências dos aminoácidos foi realizado com o programa Clustral W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw).
2.9.2. Análise filogenética
A análise filogenética foi realizada baseada em alinhamento de domínios, utilizado o programa MEGA versão 5.2 (http://www.megasoftware.net/) (TAMURA et al., 2011). A história evolutiva das sequências obtidas do banco de dados do NCBI foi inferida utilizando o método de máxima parcimônia e o teste de bootstrap foi aplicado sob a condição de 100 replicações.
2.9.3. Predição da estrutura secundária
A predição da estrutura terciária da octaprenil pirofosfato sintase de Plasmodium
falciparum foi realizado a partir das sequências de aminoácidos (obtidas do NCBI Reference
Sequence: XP_001349541.1) por homologia baseado em um tamplate, utilizando a ferramenta Phyre2 (http://www.imperial.ac.uk/phyre/), também conhecida como modelagem comparativa (KELLEY et al., 2015).
2.9.4. Docking
O docking molecular entre os compostos 4a ou 4c e a OPPs predita foi feito usando a ferramenta AutoDock Vina versão 0.8 que foi rodado em um computador contendo Windows 10. O programa Chimera (PETTERSEN et al., 2004) foi usado para visualização das imagens com alta resolução.