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Utilizando o banco de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy) (http://www.cazy.org/ (Cantarel et al., 2009) um total de 202 enzimas putativas que degradam polissacarídeos foram identificados no genoma de A. oryzae RIB40, representando 76 famílias de enzimas. Essa anotação do genoma do fungo prediz uma diversidade de arranjos de genes que codificam enzimas CAZy. Cinco classes principais estão envolvidas na decomposição da parede celular das plantas, chamadas de Glicosil Hidrolases (GH), Carboidrato Esterases (CE), Glicosil Transferases (GT), Polissacarídeos Liases (PL) e Módulos de Ligação ao Carboidrato (CBM).

Enzimas pertencentes à família GH são conhecidas pela catálise da hidrólise de ligações glicosídicas entre dois ou mais carboidratos, já enzimas da família GT são responsáveis pela biossíntese de dissacarídeos oligo e polissacarídeos. Elas catalisam a transferência de unidades de açúcar do doador ativo para o aceptor de moléculas especifico, formando ligações glicosídicas. Enzimas da família PL realizam a clivagem da cadeia de polissacarídeos que contem ácidos urônicos, liberando resíduos de ácido urônicos insaturados. Enzimas da família CE catalisam a acetilação –N ou –O de sacarídeos substituídos. Duas classes de substratos são consideradas para as CEs, aqueles que o

açúcar funciona como ácido como, a pectina metil esterase, e aqueles que o açúcar tem o comportamento de álcool como a xilana acetilada.

A análise da expressão diferencial dos genes que codificam enzimas CAZy revelaram um total de 2,57% genes GH, 0,29% genes CE, 0,19% genes PL, 1,25% genes GT e 0,09% genes CBM. Os genes que codificam enzimas GH foram os mais presentes e apresentaram grande diversidade de famílias GH com 62 famílias, seguido por 30 famílias GT, 9 famílias de CBM, 8 famílias de CE e 5 famílias de PL. Resultados conferem uma grande diversidade na expressão de genes que codificam enzimas lignocelulolíticas.

De acordo com a classificação CAZy, as famílias GH 1, 3, 6, 7 representam as enzimas com atividade celulósica. As celulases são representadas pelas β-1,4-glucosidases (EC 3.2.1.21) encontradas nas famílias GH1 e 3, as β-1,4-endoglucanase (EC 3.2.1.4) encontrada na família GH7, as celobiohidrolases (EC 3.2.1.91) encontradas nas famílias GH6 e 7, α-glucosidase (EC 3.2.1.20) da família GH13, β-1,3(4)-endoglucanase (EC 3.2.1.6) da família GH16, β-1,3-endoglucanase (EC 3.2.1.39) da família GH81. (de Brink & de Vries, 2011). A análise de transcritômica do A. oryzae BLU37 sob diferentes tratamentos, mostrou genes das famílias GH6 e 7 com níveis acima de 10 vezes mais expressos nos tratamentos LB36, LB48 e SB36 em comparação com os tratamentos com glicose. Genes da família GH3 também foram detectados níveis elevados de expressos. Estudos da análise de sete Aspergilli que possuem o genoma sequênciado, apresentaram entre três e cinco genes que codificam celobiohidrolases. Dois desses genes são típicos das famílias CAZy GH6 e GH7. As análises revelaram duas celobiohidrolases, Cbh1 e CelD. Estudo mostra que a Cbh1 possui um domínio de ligação ao carboidrato que se liga a celulose e aumenta a especificidade, diferente da CelD que não possui. A Cbh1 mostrou ser mais estável a inativação por temperatura menos sensível a inibição por glucose quando comparada com a CelD. Entretanto, em atuação conjunta, ambas as enzimas apresentam uma forte sinergia de hidrólise em resposta à substratos celulósicos (Segato et al., 2012). Um gene da família GH61, CBM1 precursor de uma endoglucanases tive a sua expressão aumentada em mais de 5 vezes nos tratamentos com bagaço de cana-de-açúcar.

Genes da família GH responsáveis pela hidrólise da hemicelulose também tiveram a sua expressão diferencial identificada nos tratamentos de A. oryzae cultivado em bagaço de cana-de-açúcar em comparação com os tratamentos de A. oryzae cultivado em glicose. O nível de expressão dos genes da família GH10 e 11 foram os mais expressivos com regulação positiva de até 15 vezes entre os tratamentos. Dentre as enzimas hemicelulósicas identificadas está a β-1,4-endoxilanase (EC 3.2.1.8) encontradas nas famílias GH10 e 11. Diferenças nas estruturas do domínio catalítico das endoxilanases (GH 10 e 11), resultam na especificidade dessas enzimas aos substratos. Endoxilanases (GH10) possuem ampla especificidade ao substrato diferente das endoxilanases (GH11). Além de hidrolisarem cadeias lineares 1,4-ligado a resíduos de D-xilose, as endoxilanases (GH10) hidrolisam cadeias principais de xilana com alto grau de substituições. São importantes para a degradação completa de xilanas substituídas, diminuindo a necessidade de enzimas

acessórias (Pollet et al., 2010).

A degradação completa da hemicelulose depende da hidrólise das substituições presentes na cadeia principal da hemicelulose. Monômeros como a D-galactose, D-xilose, L- arabinose e D-ácido galacturônico são as substituições mais freqüentemente encontradas. Nesse estudo, α-xilosidase (EC 3.2.1.177) encontrada na família GH31, teve a expressão gênica aumentada quando na presença do bagaço de cana de açúcar. Essa enzima libera resíduos de D-xilana com ligações α presentes na cadeia principal da xiloglucana. Todas as α-xilosidase possuem grande especificidade aos resíduos com ligação α-xilose, mas diferem no tipo de hidrólise glicosídica. Enzimas de A. niger atuam nas p-nitrofenil-α-D- xulanopiranosideo, isoprimeverose e oligossacarídeos derivados de xiloglucana. α-xilosidase I de A. flavus também atuam nesses três substratos, entretanto a α-xilosidase II só atua na p- nitrofenil-α-D-xulanopiranosideo. α-xilosidase I possui produção constitutiva, enquanto a α- xilosidase II possui produção da enzima somente quando o fungo é induzido pela xilose (Yoshikawa et al., 1993).

A expressão diferencial do gene α-1,2-L-fucosidase (EC 3.2.1.63) encontrado na família GH95 foi identificada somente nos tratamentos com bagaço de cana de açúcar. α- fucosidases (GH95) são conhecidas pela a hidrólise de resíduos de L-fucose da xiloglucana. Estudos com A. niger, A. nidulans têm relatado a presença de α-fucosidases na presença da biomassa lignocelulósica (Souza et al., 2011; Saykhedkar et al., 2012).

As enzimas α-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) da família GH51, arabinoxilana arabinofuranohidrolase (EC 3.2.1.55) da família GH62, Exoarabinase (EC 3.2.1.-) da família GH93, também tiveram a expressão gênica diferencial identificada nesse estudo. As enzimas α-arabinofuranosidase (GH51) e arabinoxilana arabinofuranohidrolase (GH62) hidrolisam a arabinose-substituída xiloglucana e (arabino-) xilana encontrados na L-arabinose, resíduo comum da hemicelulose e pectina. Duas arabinofuranosidases de A. niger uma apresentando atividade específica por ligações α-1,3-ligado à resíduos de arabinose terminal, e a outra por α-1,2-, α-1,3- e α-1,5-ligado à resíduos de arabinose terminal (174 e 34). Arabinoxilana arabinofuranohidrolases atuam especificamente nas ligações α-1,2- ou α- 1,3- dos resíduos de L-arabinose da arabinoxilana, mas também atua nas substituições adjacentes de resíduos de D-xilose (Verbruggen et al., 1998). Em conjunto com α- arabinofuranosidase e arabinoxilana arabinofuranohidrolase atua sinergicamente a Exoarabinase (GH93) liberando resíduos de arabinose terminal. Em estudo do proteoma extracelular de A. nidulans cultivado em sorgo, foi encontrada uma exoarabinase (GH93) (Saykhedkar et al., 2012).

Resíduos de L-arabinose são indutores da expressão da α-arabinofuranosidase e arabinoxilana arabinofuranohidrolase. Estudo da expressão de duas arabinofuranosidase (abfA e abfB) indicaram que o L-arabitol é o responsável pela regulagem da expressão gênica e indução extracelular de arabinofuranosidase em A. nidulans (de Vries et al., 1994). Também foi demonstrado que L-arabinose controla o sistema regulatório da expressão do

gene β-1,4-endogalactanase (galA) (GH53) em A. niger (de Vries et al., 2002), sugerindo que a regulação da produção dessas enzimas são reguladas pela presença de L-arabinose e L- arabitol.

Enzimas que liberam resíduos de D-galactose, identificadas nesse estudo, são as α- 1,4-galactosidases (EC 3.2.1.22) encontradas nas famílias GH27 e 36. α-galactosidase (GH27) possuem atividade α-N-acetilgalactosaminidase, enquanto α-galactosidase (GH36) são ativas contra mono e oligossacarídeos como, melibiose e rafinose (Ademark et al., 2001).

α-glucuronidase (EC 3.2.1.139) da família GH67 também foi identificada pela sua expressão gênica diferencial positiva nos tratamentos com bagaço de cana de açúcar. Essas enzimas liberam resíduos de D-ácido galacturônico da hemicelulose. α-glucuronidase (GH67) possuem especificidade a curtos oligossacarídeos e são encontradas exclusivamente dentro do grupo dos ascomicetos (Chong et al., 2011). α-glucuronidase (água) de A. niger revelou a presença de quatro sítios de ligação putativos de creA e um sitio para xlnR na região do promotor, indicando que creA e xlnR possuem grande influência na regulação desse gene (de Vries et al., 2002a).

β-1,4-endogalactanase (EC 3.2.1.89) da família GH53 foram identificadas, nesse estudo, na hidrólise de cadeias laterias da galactana presente na pectina. O produto liberado dessa hidrólise inicial por A. niger é a D-galactotriose e D-galactotetraose, entretanto incubação prolongada também resulta na liberação de galactobiose e galactose. É conhecido que β-1,4-endogalactanase de A. niger age sinergicamente com ramnogalacturonanas de Aspergillus (de Vries et al., 2002b).

A enzima α-amilase (EC 3.2.1.1) da família GH13 também foi identificada com expressão diferencial positiva somente nos tratamentos de A. oryzae utilizando o bagaço de cana de açúcar como única fonte de carbono. Genes que expressam enzimas amilolíticas são comumente regulados por AmyR. AmyR é induzido pela presença de maltose, um dissacarídeo presente no amido (Carlsen & Nielsen, 2001). Em A. oryzae e A. nidulans, AmyR mostrou ativar a expressão de glucoamilase, α-amilase e α-glucosidase na presença de amido ou maltose (Petersen et al., 1999). Entretanto, um segundo sistema de indução, diferente do sistema de indução AmyR, pode atuar na expressão de enzimas amilolíticas. Entretanto, genes em A. niger e A. oryzae regulados por AmyR, podem ser induzidos em cultivos com baixos níveis de D-glucose, a medida que a sua expressão aumenta durante o período de cultivo. Assim como a D-glucose tem se mostrado agir como repressor, por meio da proteína catabólica repressora de carbono, CreA, os níveis de expressão dos genes amilolíticos parecem estarem balanceados entre a indução do AmyR e a repressão por CreA. (de Vries et al., 2012). de Vries et al. (1999) mostrou efeito similar para D-xilose e o regulador de enzimas xilanolíticas e celulolíticas, XlnR, no qual uma alta concentração de D- xilose resultou na redução da expressão de genes xilanolíticos mediada pela repressão do CreA.

Outra enzima da família GH identificada com expressão diferencial positivia, presente somente nos tratmamentos de A. oryzae cultivado em bagaço de cana de açúcar, é a β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) da família GH20. Essa enzima possui função de quitinase. Quitinases, além das lípases e peptidases, contribuem no remodelamento da parede celular durante a germinação celular, crescimento e morfogêneses. Enzimas com função de quitinase catalisam a quebra da quitina, um polímero linear encontrado com insetos, crustáceos e parede celular de fungos consistindo de β-1,4-ligado N- acetilglucosamina (Chipman et al., 1967). Análise proteômica de enzimas lignocelulósicas secretadas por A. nidulans cultivado em sorgo e Phanerocharte chrysosporium cultivado em palha de milho, feno, bagaço de cana de açúcar, farelo de trigo e lascas de madeira, revelaram a presença de quitinases entre as enzimas lignocelulósicas (Saykhedkar et al., 2012; Adav et al., 2012). Estudo da repressão da autólise e conidiogêneses de Emericella nidulans revelou que a repressão mediada por glicose, do fator de transcrição da esporulação (brlA), contribuiu para a regulação negativa da conidiogêneses. Embora o repressor CreA tenha tido papel importante na regulação da autólise por meio da repressão de genes que codificam hidrolases autolíticas como a quitinase (ChiB), a produção da atividade de quitinase também foi afetada negativamente pela regulação negativa da expressão de brlA (Emri et al., 2006).

Assim como as quitinases, as lisozimas representam uma classe importante de enzimas que hidrolisam polissacarídeos. A expressão diferencial positiva da lisozima (EC 3.2.1.17) encontradas na família GH24, foi identificada somente nos tratamentos usando o bagaço de cana de açúcar como única fonte de carbono. As lisozimas possuem a função de hidrólise de peptídeoglucanos presente na parede celular de bactérias, hidrolisando ligações β-1,4-ligado a resíduos de ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglucosamina (Chipman et al., 1967). A semelhança química entre os dois substratos de quitina e lisozima, levam ao fato que algumas lisozimas podem também hidrolisar a quitina, porém menos eficiente que a hidrólise com seu substrato natural. Entretanto, ambas as enzimas não apresentam similaridades entre as suas sequências de aminoácido (Wohlkonig et al., 2010).

Para degradação completa da hemicelulose, todas as substituições na cadeia principal da hemicelulose devem ser liberadas. Esse processo envolve além da atividade de enzimas das famílias GH, atividade de enzimas das famílias CE. Genes das famílias CE1 e 8 tiveram seu nível de expressão aumentado em mais de 13 vezes nos tratamentos LB36, SB48 e SB36 em comparação com os tratamentos LG36, SG48 e SG36. Genes pertencentes as famílias CE12 e CE16 também apresentaram expressão aumentada em mais de 5 vezes nos tratamentos com bagaço de cana. Essas famílias CE1, 12 são conhecidas por codificarem enzimas como as acetilxilana esterases (EC 3.1.1.72). Assim como genes da família CE16 com função predita à acetilesterases (EC 3.1.1.6). Genes da família CE8 possuem atividades de pectina metilesterases (EC 3.1.1.11).

Acetilxilana esterases são conhecidas por hidrolisarem o acetil da xilose O-2 ou O-3 da cadeia principal da xilana. A acetilxilana esterase, pertencente ao grupo de enzimas

acessórias, é muito ativa em substratos poliméricos e importante para a degradação eficiente da cadeia principal da xilana pelas endoxilanases. Acetilxilana esterase de A. niger possui forte ação sinérgica com as endoxilanases I, II e III, resultando no aumento da liberação de xilose, quando sob lascas de madeira pré-tratada (Kormelink et al., 1993). Acetilesterases estão ativas em diversos carboidratos acetil ésteres. As pectinas acetilesterases liberam resíduos de acetil de regiões lisas da cadeia de pectina, agindo sinergicamente com pectinas metiltrasferases e pectinas liase. Outra enzima acetilesterase é a ramnogalacturonana acetilesterase (de Vries, 2001).

A degradação completa da pectina envolve duas classes de enzimas pertencentes às famílias GH e PL. Nesse estudo, foram identificados três famílias de polissacarídeo liases com expressão aumentada em mais de 5 vezes nos tratamentos de A. oryzae cultivado em bagaço de cana-de-açúcar. As famílias CAZy identificadas foram a PL1, a pectina liase (EC 4.2.2.10) e a PL1, 3 e 9 de pectato liase (EC 4.2.2.2). A pectina e o pectato liases ambos liberam resíduos de D-ácido galacturônico de dentro de regiões menos densas da pectina. Apesar de liberarem o mesmo resíduo, ambas as liases apresentam diferenças importantes em seus sítios ativos. A pectina liase atua preferencialmente em substratos com altos níveis de metil esterificação e possui pH ótimo alcalino (pH5,5). Já o pectato liase atua em substratos com baixo nível de esterificação e possui pH ótimo básico (pH8,5) (Mayans et al., 1997).

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