Essa família de enzimas é composta por membros que são capazes de hidrolisar nucleosídeos 5’- trifosfatos e/ou nucleosídeos 5’ difosfatos. Essa família possui, também, outros nomes como ecto-apirase, CD39, ATPDase, NTPase ou E-ATPase. Acreditava-se que a quebra de ATP via ADP para AMP fosse mediada por atividades ATPase e ADPase separadas. Contudo, o termo E-NTPDase foi mais apropriado devido ao fato de esse grupo de enzimas ter a capacidade de hidrolisar nucleosídeos purínicos e pirimidínicos tri e difosfatados, presentes no meio extracelular, por remoção seqüencial dos fosfatos γ e β. Segundo Robson e cols., 2006, depois de confirmada a nomenclatura, as proteínas da família NTPDase foram classificadas de acordo com a ordem de descoberta. Embora grande parte dessas proteínas sejam ectoenzimas, ocorrem também, formas solúveis no meio extracelular, que são referidas como exoenzimas. Adicionalmente, ocorrem isoformas de apirases localizadas na memmbrana do aparato de Golgi de alguns eucariotos, como leveduras e humanos (Zimmermann, 1999; Zimmermann, 2000). Os membros individuais da família das NTPDases presentes nas superfícies celulares de mamíferos diferem na dependência do pH, especificidade pelo substrato e produto de formação (Kukulski e cols., 2005).
As E-NTPDases atualmente conhecidas, para eucariotos superiores, são oito, agrupadas como enzimas localizadas na superfície celular as NTPDase 1, -2, -3 e -8. Já as NTPDases 5 e 6 exibem localização extracelular, podendo também serem secretadas. As NTPDases 4 e 7 são completamene intracelularmente localizadas faceando o lúmem de organelas citoplasmáticas (Yegutkin, 2008).
As NTPDases de superfície celular (E-NTPDases) são responsáveis pela modulação da sinalização nas terminações purinérgicas (Zebisch & Sträter, 2007). Semelhantemente às outras NTPDases, as NTPDases 1, -2, -3 e -8 possuem cinco pontes dissulfeto que estabilizam o ectodomínio (Ivanenkov e cols., 2003; Ivanenkov e cols., 2005). A família das E-NTPDases foi inicialmente descrita por dois grupos independentes e foi chamada inicialmente de família das apirases, CD39 ou ATP- difosfohidrolases ((Handa e cols., 1996; Vasoncelos et al., 1996). Todas os membros da família NTPDase de superfície celular são proteínas altamente glicosiladas com uma massa molecular média de aproximadamente 50 a 80 KDa.
As NTPDases 1, -2 e -3 recombinantes de rato expressas em bactérias, possuem características que refletem a ausência das regiões trasmembrana e da glicosilação, nesta forma estas proteínas apresentam estrutura monomérica, sendo preferencialmente ativadas por Mg2+ como cofator enzimático, em comparação com o Ca2+. Enquanto os
tipos selvagem das NTPDases 1, -2, -3 e -8 humanas apresentam-se na forma oligomérica (Zimmermann, 2000; Zimmermann, 2001; Failer e cols., 2003; Robson e cols., 2006). Embora se consiga essas enzimas ativas através da expressão heteróloga em bactérias, muitos trabalhos têm mostrado que a glicosilação é de grande importância para o processamento e função dessas enzimas (Eisenberg e cols., 1997; Mulero e cols., 2000; Murphy-Piedmont e cols., 2005; Wu e cols., 2005).
Para a atividade máxima de hidrólise das apirases são necessárias concentrações milimolares de cátions divalentes, Ca2+ e Mg2+. Devido a esse fato, é comum utilizar sais MgCl2 e CaCl2 nos tampões de ensaios de extração de NTPDases recombinantes,
para que essas se mantenham ativas. A NTPDase 1 de rato e humana tipo selvagem mostra igual preferência pelos íons Ca2+ e Mg2+, enquanto a NTPDase 3 de rato e humana tem maior preferência pelo Ca2+ (Heine e cols., 1999; Vorhoff e cols., 2005; Kukulski e cols., 2005).
De acordo com a trabalho de Zebisch & Sträter em 2007, vários íons metálicos divalentes possuem a capacidade de ativar a hidrólise de ATP de ectodomínios purificados de NTPDases. Eles mostram a alta atividade específica para as NTPDases 1, 2 e 3 de rato na presença de íons Mg2+, Ca2+, Zn2+, Sr2+, Co2+ e Cd2+. Nesse trabalho é também, possível perceber a influência do pH na estrutura espacial e na atividade das NTPDases 1, 2 e 3, uma vez que a razão de hidrólise ATP/ADP é diretamente dependente desta variável. No ectodomínio recombinante da NTPDase 1 de rato o pH ótimo é neutro a alcallino; para a NTPDase 2 o pH deve ser de 7,0 a 8,5, e para a NTPDase 3 este deve estar num intervalo de 4,5 a 10,0.
Quanto à hidrólise do substrato, existem grandes diferenças no curso de formação dos produtos para as NTPDases. A NTPDase 1 humana, de rato e de porco hidrolisa nucleotídeos trifosfatos tão bem quanto difosfatos. Sendo que o tipo selvagem da enzima, presente na membrana, apresenta forma oligomérica e hidrolisa ATP
ADP. Além disso, a NTPDase 2 de rato e de porco hidrolisa ATP preferencialmente, mas também hidrolisa ADP com uma eficiência diminuída de 10 a 15 vezes. Contudo, as NTPDases 3 e 8 humanas estão descritas como intermediários funcionais entre as NTPDases 1 e 2 humanas (Heine e cols., 1999; Kukulski & Komoazynski, 2003; Chen e cols., 2001; Kukulski e cols., 2005). Nas NTPDases-1 e -2 de rato a oligomerização é mediada pelas regiões transmembrana. E na NTPDase-3 de rato essa estruturação é feita via glicosilação das cadeias laterais. A habilidade da NTPDase 1 de rato em reter ADP em seu sítio catalítico depende da oligomerização via domínio transmembrana (Chen e cols., 2001). O acúmulo dessa molécula é transitório no caso da NTPDase 3, e permanente no caso da NTPDase 2, ambas de rato (Kukulski e cols., 2005). Em comparação com as NTPDases extracelulares as NTPDases 4, 5 ,6 e 7 são menos ativas na quebra de ATP e ADP, enquanto as NTPDases 5 e 6 clivam mais especificamente difosfonucleosídeos. Tem sido sugerido que estas também participam na transferência e nos processos de transporte dos nucleotídeos-açúcar (Trombetta & Helenius, 1999; Braun e cols., 2000; Shi e cols., 2001). A NTPDase 1 endotelial limita a extensão da agregação plaquetária intravascular pela conversão da molécula pró-agregatória ADP para a molécula anti-agregatória adenosina (Kaczmarek e cols., 1996, Marcus e cols., 1997, Imai e cols., 1999).
As taxas de atividade ATPase:ADPase são alteradas quando há ausência das hélices trasmembrana, isto foi verificado através da expressão heteróloga dos domínios extracelulares das NTPDases 1, 2 e 8 de humanos (Grinthal & Guidotti, 2000; Grinthal & Guidotti, 2002; Knowles & Li, 2006 ). Uma vez que a expressão heteróloga bacteriana de ectodomínios carentes em regiões transmembrana apresenta a forma oligomérica, é possível inferir que a oligomerização é mediada por essas regiões, pelo menos nas NTPDases 1 e 2 de humanos (Enjyoji e cols., 1999; Chen & Guidotti, 2001; Grinthal & Guidotti, 2002 ). Quanto à NTPDase 3 humana, parece que a glicosilação de cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos é que possivelmente promove a oligomerização (Smith & Kirley, 1999).
A similaridade de aminoácidos do domínio catalítico de diferentes NTPDases é especificamente alta somente em cinco regiões conservadas, chamadas “Apyrase Conserved Regions” (ACRs) (Handa & Guidotti, 1996). O ectodomínio solúvel da
inibição da agregação plaquetária (Gayle e cols., 1998; Pinski e cols., 2002; Belayev e cols., 2003; Marcus e cols., 2003; Buergler e cols., 2005; Haller e cols., 2006).
No trabalho de Kirley e cols., 2006, a NTPDase-3 de rato foi utilizada como modelo, sendo extrapoladas as conclusões para as NTPdases-1, -2, -3 e -8, que estão presentes nas superfícies de diversos tecidos humanos e de ratos para determinar aspectos estruturais, valendo-se de técnicas de mutagênese sítio-dirigida e modelagem computacional comparativa. Com isso, foi possível sugerir os papéis funcionais e estruturais das ACRs, das duas hélices transmembrana presentes nas porções N- e C- terminal e seus movimentos em resposta ao substrato. Foi mostrado que os domínios transmembrana têm importância no controle e modulação da atividade enzimática. Pelos resultados obtidos com as mutações sítio dirigidas é perceptível que com poucas modificações de aminoácidos nas ACRs verificam-se alterações na preferência e processividade da hidrólise dos substratos; bem como na preferência do cátion divalente requerido. Além disto, foi vista a importância das histidinas e glicinas para a formação da estrutura terciária e a estabilidade enzimática. Resíduos conservados de prolina dão a rigidez necessária à formação da estrutura, ao mesmo tempo, permitem a mobilidade da mesma. Pelo modelo computacional postulou-se como as modificações rotacionais dos domínios extracelulares, presentes também, na superfamília actina, são importantes para a atividade enzimática. Além disto, os domínios ligantes de fosfato parecem estruturados em folhas- em porções das ACR1 e ACR4. Adicionalmente, essa modelagem computacional dá ascensão à idéia de que existe grande similaridade estrutural entre as NTPDases -1, -2, -3, -5, -6 e -8 de ratos e humanos.
Os membros dessa família de enzimas são ubíquos a vários organismos eucariotos como protozoários, leveduras, invertebrados, plantas e vertebrados (Zimmermann, 1999). Além disso, há descrita a presença de NTPDases em um organismo procarioto, a Legionella pneumophila (Sanson e cols., 2007). Sendo observada essa vasta distribuição dessas proteínas nos diversos patamares evolutivos da natureza. Com isso, pode-se inferir que as E-NTPDases são um grupo de moléculas “bem sucedidas” ao longo de sua história evolutiva, por terem surgido nos primórdios da vida e terem se sobressaído até os dias atuais em organismos superiores. O
amazonensis, de Leishmania brasiliensis, de batata e de humanos pode ser visto na
figura 4.
Têm sido sugeridos vários papéis funcionais para a família CD39, tais como conferir proteção aos linfócitos do efeito lítico, causado pela liberação de ATP extracelular por células alvo (Filippini e cols., 1990; Di Virgilio, 1995); envolvimento na adesão de linfócitos B ativados por vias mediadas pela integrina (Kansas e cols., 1991); na ação como componente crítico na tromboregulação, pelo controle dos níveis de ADP, um agonista plaquetário (Marcus, 1997); ação potencial na reciclagem da adenosina (Plesner, 1995), demielinação e remielinação de axônios (Felts & Smith, 1996); na sinalização nas terminações purinérgicas e no desenvolvimento e manutenção dos neurônios (Zimmermann, 1996).
NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.brucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.rucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human ENTP-1 Human ENTPDase3 Human ENTP7 Human ENTP4 Human ENTPD IIL.neumophilla ENTPDase I L.pnemophila NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.brucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human ENTP-1 Human ENTPDase3 Human ENTP7 Human ENTP4 Human ENTPD IIL.neumophilla ENTPDase I L.pnemophila NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.brucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human ENTP-1 Human ENTPDase3 Human ENTP7 Human ENTP4 Human ENTPD IIL.neumophilla ENTPDase I L.pnemophila
NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.brucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human ENTP-1 Human ENTPDase3 Human ENTP7 Human ENTP4 Human ENTPD IIL.neumophilla ENTPDase I L.pnemophila NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.brucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human ENTP-1 Human ENTPDase3 Human ENTP7 Human ENTP4 Human ENTPD IIL.neumophilla ENTPDase I L.pnemophila NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.brucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human ENTP-1 Human ENTPDase3 Human ENTP7 Human ENTP4 Human ENTPD IIL.neumophilla ENTPDase I L.pnemophila NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.brucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human ENTP-1 Human ENTPDase3 Human ENTP7 Human
Figura 4- Alinhamento de seqüências primárias deduzidas de E-NTPDases. Em verde
estão os aminoácidos totalmente conservados, em amarelo estão os conservados na maioria das proteínas, em azul, mutações conservativas e em branco, os não conservados. As caixas vermelhas delimitam as prováveis regiões conservadas somente entre os parasitas. As sequências e os números de acesso nos bancos de dados são NTPDase-L.major gi_6812536, nucleoside diphosphatase_L.infantum ref_XP_001464341.1, nucleoside diphosphatase_L.braziliensis ref_XP_0015621, guanosine diphosphatase_L.major ref_XP_0016813245.1, guanosine diphosphatase- _L.infantum ref_XP_001463665.1, nucleoside phosphatase_T.cruzi CL Brener ref_XP_809354.1, NTPDase-1-T.cruzi-Y gb_AA57559.1, guanosine diphosphatase- _L.braziliensis ref_XP_001562788.1, NTPDase-T.brucei gi_45120586, nucleoside diphosphataseT.brucei ref_XP_845817.1, ENTP5-human-genome gi_119601559, ENTP6-human-genome gi_119630504, Potato apyrase gi_1381633, ENTP-2-isofor 1- human gi_45827718, ENTP8-human gi_158705943, ENTP_1 human-vascular gi_1705710, ENTP3-human-genome gi_119585005, ENTP7-human-genome gi_119570245, ENTP4-human-genome gi_119584025, ENTP II-L.neumophila gi_52841206, ENTPDase I-L.pneumophila ref_YP_095922.1, respectivamente.
NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.brucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human ENTP-1 Human ENTPDase3 Human ENTP7 Human ENTP4 Human ENTPD IIL.neumophilla ENTPDase I L.pnemophila NTPDase L. major NPDase L.infantum NPDase L.braziliensis GDPase L. major GDPase L.infantum NTPDase T.cruzi NTPDase-1 T.cruzi-Y GDPase L.braziliensis NTPDase T.brucei NDPase T.brucei ENTP5 Human ENTP6 Human Apirase de batata ENTPDase2 Human ENTPDase8 Human ENTP-1 Human ENTPDase3 Human ENTP7 Human ENTP4 Human ENTPD IIL.neumophilla ENTPDase I L.pnemophila