Um grupo de animais foi imunizado com 2 doses de proteína recombinante rLIC11834, enquanto um outro grupo com 3 doses de proteína recombinante rLIC12253, e sangrados via plexo retro-orbital após cada dose. Os soros obtidos foram avaliados quanto à presença de anticorpos anti-rLIC11834 e anti-rLIC12253. Os títulos de anticorpos policlonais presentes no soro dos animais de cada grupo foram avaliados por ELISA.
O grupo imunizado com a proteína rLIC12253 só apresentou títulos de anticorpos após a segunda dose, por isso a necessidade de uma dose a mais, quando comparado com a rLIC11834, a qual já apresentou altos títulos após a primeira dose. O grupo controle (PBS), por sua vez, não apresentou quaisquer títulos, assim como o soro dos animais pré-imunes (dados não mostrados). O maior título de anticorpos obtidos em pelo menos um animal de cada grupo após cada imunização é apresentado na tabela 3.
Tabela 3 - Títulos de anticorpos policlonais obtidos após imunização de camundongos com
as proteínas recombinantes
Proteína
recombinante 1ª sangria 2ª sangria 3ª sangria
rLIC11834 409.600 6.553.600 -
rLIC12253 0 12.800 204.800
Como mostra a tabela 3, todas as proteínas recombinantes mostraram um aumento dos títulos de anticorpos entre as imunizações, apresentando, ao final, títulos significativos.
Para demonstrar a especificidade de anticorpos anti-rLIC11834 e anti-rLIC12253, além do ELISA, realizou-se Western blotting no qual foi possível a visualização do anticorpo ligado à proteína recombinante. Realizou-se primeiramente o ensaio com anticorpo específico (1:1000) por 1 hora a temperatura ambiente (Figura 20).
Figura 20 – Reconhecimento de anticorpos específicos pelas proteínas recombinantes
(A) Anti-rLIC11834 e (B) Anti-rLIC12253 foram detectados pelo contato com proteínas recombinantes específicas (marcador molecular indicado por KDa).
Verificou-se sinal fraco para rLIC12253, provavelmente devido ao menor título apresentado pelo anticorpo específico. Portanto, repetiu-se o ensaio, porém, além da diluição dos anticorpos 1:1000, realizou-se diluição 1:500 e, para rLIC12253, também 1:300 e modificou-se o tempo e temperatura de incubação desses anticorpos (3 horas a 37ºC) (Figura 21).
Figura 21 – Reconhecimento de diferentes concentrações de anticorpos específicos pelas proteínas recombinantes
(A) Anti-rLIC11834 e (B) Anti-rLIC12253 foram detectados pelo contato com proteínas recombinantes específicas (marcador molecular indicado por KDa).
Como pode-se analisar na figura 21, houve aumento do sinal dependente da concentração do anticorpo: quanto maior a concentração, mais forte o sinal. E também pode- se verificar, juntamente com os resultados de análise dos títulos de anticorpos policlonais por ELISA, que se tratam de proteínas imunogênicas.
Após as imunizações, os camundongos foram sacrificados, os baços foram extraídos e processados, para subsequente cultura celular e análise da linfoproliferação e determinação de citocinas.
As células de todos os grupos se mostraram viáveis, o que é observado pela alta proliferação dos esplenócitos estimulados com o mitógeno ConA, o qual é uma lectina (proteína ligante de carboidrato) com alto potencial de induzir mitose.
Nenhuma das proteínas recombinantes induziu uma resposta celular, já que não foi obervada proliferação dos esplenócitos quando estes foram estimulados in vitro pelos antígenos (Figura 22). Ou seja, não houve estimulação da linfoproliferação pelas proteínas recombinantes.
Figura 22 - Avaliação de linfoproliferação
A proliferação de linfócitos foi analisada a partir de células de baço de camundongos imunizados com rLIC1184 (A) ou com rLIC12253 (B), ou ainda animais controle, imunizados com PBS. As células foram cultivadas e, então, estimuladas com meio (controle negativo), mitógeno ConA (controle positivo, 5 μg/mL) ou proteína recombinante (5 μg/mL). A resposta de proliferação foi medida pelo ensaio colorimétrico ELISA-BrdU. Os valores representam o valor de Abs ± desvio padrão de dois experimentos independentes. As comparações para análise estatística foram feitas pelo Student´s two tailed t test entre as médias do tratamento no qual as células foram estimuladas com a proteína, entre o grupo imunizado e grupo PBS.
Para mensuração das citocinas liberadas com objetivo de discriminar a indução de uma resposta imune celular (Th1) ou humoral (Th2) pelas proteínas recombinantes, níveis de IL-4, IL-10, IL-12, IFN- e TNF-α foram avaliados por ELISA utilizando kits comerciais. IL-4 e IL-10 foram utilizadas como marcadores de resposta imune Th2, enquanto que IL-12, IFN- e TNF-α foram utilizadas como marcadores de resposta Th1. (Figura 2γ).
Mastócitos e células T CD4+, após ativação da resposta imune adaptativa, são os principais produtores de IL-4, estimulando o desenvolvimento de células Th2. Macrófagos e linfócitos Th2 são os principais produtores de IL-10, o qual atua inibindo os próprios macrófagos, além de ser uma citocina moduladora, restringindo e impedindo uma resposta imune excessiva e danos colaterais (SABAT et al., 2010). Células Th1 CD4+, T CD8+ e NK (natural killer) produzem IFN- , a qual atua tanto na imunidade inata quanto na imunidade adaptativa ativando macrófagos e estimulando a proliferação de mais células Th1. IFN- ainda aumenta a síntese de TNF-α por macrófagos estimulados por LPS, e este atua nas células do endotélio vascular e leucócitos estimulando o recrutamento de neutrófilos e monócitos para o local da infecção. Células apresentadoras de antígenos, principalmente durante uma resposta às infecções por bactérias intracelulares e vírus, produzem IL-12, q qual
estimula a diferenciação de células T CD4+ em células Th1 e a produção de IFN- (AMSEN; SPILIANAKIS; FLAVELL, 2009).
Figura 23 - Avaliação da resposta de citocinas resultante da imunização de camundongos
com as proteínas recombinantes após estímulo in vitro
A
B
Células de baço foram isoladas dos camundongos imunizados com rLIC11834 (A) e rLIC12253 (B), e cultivadas em placa de cultura de 24 poços. Após 48 horas, o sobrenadante da cultura foi coletado e as citocinas IL-4, IL-10, Il-12, IFN- e TNF-α foram dosadas por um kit de ELISA. Os valores de absorbância obtidos foram comparados com os valores de uma curva padrão contendo concentrações conhecidas de cada citocina. Para análise estatística, primeiramente foi avaliada a diferença entre as médias do tratamento no qual as células foram
estimuladas com a proteína, entre o grupo imunizado e grupo PBS (controle negativo). Sendo detectada diferença significativa, a análise estatística foi então feita dentro do grupo dos animais imunizados entre o tratamento proteína e meio pelo Student´s two tailed t test, e o p- valor mostrado no gráfico se refere a esta última análise (* P <0,05).
O grupo imunizado com rLIC11834 apresentou um aumento significativo para citocina IL-10 após estimulação com o antígeno. Nenhum outro aumento nas concentrações de citocinas foi obervado.
Assim sendo, analisando todos os resultados, os dados indicam que as proteínas recombinantes estimulam apenas resposta humoral, já que, além de produzirem consideráveis títulos de anticorpos policlonais, não promoveram a linfoproliferação, e quanto à liberação de citocinas, observou-se aumento na produção de IL-10 pela rLIC11834, indicando resposta Th2, apesar de estudos indicarem presença de ambas respostas para outras proteínas recombinantes e para o uso do adjuvante Alhydrogel (FERNANDES et al., 2013; FERNANDES et al., 2012; REED et al., 2009).
4.12 Detecção de anticorpos IgG e IgM humanos em soro de pacientes diagnosticados com leptospirose por ELISA
A identificação de antígenos de Leptospira spp. que possam ser reconhecidos na fase inicial da doença, como as proteínas Lp29 (NEVES et al., 2007), MPL17 e MPL21 (OLIVEIRA et al., 2008) poderão facilitar o diagnóstico e tratamento precoce da doença.
Para analisar se alguma das proteínas em estudo é expressa durante o processo de infecção e pode ser aplicada como antígeno num kit diagnóstico, investigamos a reatividade com amostras de 23 soros correspondentes à fase inicial da doença, com resultado MAT negativo, e amostras de 34 soros correspondentes à fase convalescente da doença, com resultado MAT positivo através de ELISA. O teste foi realizado utilizando tanto as proteínas separadas, quanto as utilizando de forma conjunta, para análise de efeito sinérgico. O MAT é o método referência para diagnóstico da leptospirose (FAINE et al., 1999; LEVETT, 2001), porém é uma técnica que apresenta baixa sensibilidade na fase inicial da doença, já que anticorpos contra antígenos da leptospira não são detectados nos primeiros dias após a exposição (CUMBERLAND; EVERARD; LEVETT, 1999). Além disso, por se tratar de um ensaio sorovar específico, os laboratórios que realizam MAT necessitam manter culturas vivas de diferentes sorovares de Leptospira (LEVETT, 2003), o que dificulta a execução do ensaio.
Os soros tiveram sua reatividade avaliada quanto ao tipo de anticorpo produzido, IgG e IgM. Inicialmente estabeleceu-se o valor de cut-off a partir de 11 amostras de soros de indivíduos normais que relataram não terem entrado em contato com a doença e que foram diagnosticados com resultado MAT negativo, além de um pool de amostras de soros normais comercial (Sigma - Aldrich). Para este ensaio foram feitas incubações prévias dos soros com extrato de E. coli na concentração de 25%, para evitar a interferência de proteínas contaminantes desta bactéria presentes na amostra dos recombinantes.
Resultados obtidos quando se utilizou anticorpos anti-IgM humano foram semelhantes para ambas as proteínas: 3 e 0% de reatividade para MAT positivo e negativo, respectivamente (Figura 24). Já a proteína rLIC12253 mostrou 48 e 46% de reatividade para MAT positivo e negativo, respectivamente, quando houve utilização de anticorpos anti-IgG humano (Figura 24B), enquanto a proteína rLIC11834 mostrou 12 e 8% de reatividade para MAT positivo e negativo, respectivamente (Figura 24A). A análise do efeito com ambas as proteínas em conjunto foi verificada para IgG e mostrou certo sinergismo, já que houve 58% de reatividade para MAT positivo, como pode ser visto na figura 24C.
Figura 24 - Análise da reatividade de soros de indivíduos diagnosticados para leptospirose
contra (A) rLIC11834, (B) rLIC12253 e (C) rLIC11834 + rLIC12253
B
C
Amostras de soros foram analisados quanto à presença de anticorpos IgG e IgM específicos por ELISA e são apresentados como gráfico de pontos de dispersão para valores individuais. Linhas horizontais representam o cut-off calculado a partir de soros de indivíduos que relataram não terem leptospirose e um soro comercial. (A) rLIC11834. (B) rLIC12253. (C) rLIC11834 + rLIC12253.
Estes dados sugerem que a rLIC12253 seja mais reativa do que a rLIC11834, e que houve efeito sinérgico pela presença de ambas proteínas, com aumento de 10% no reconhecimento de soros de pacientes.
Por uma diluição seriada do pool dos soros dos pacientes diagnosticados com leptospirose que reagiram com as proteínas recombinantes, verificou-se qual é a maior diluição que ainda gera reatividade com as proteínas recombinantes (Tabela 4).
Tabela 4 - Títulos dos soros dos pacientes diagnosticados com leptospirose nas quais ainda há
reatividade com as proteínas recombinantes
Proteína recombinante
Soros MAT- Soros MAT+
rLIC11834 400 1.600
rLIC12253 400 6.400
Notas: MAT - Teste de microaglutinação.
Por meio destes dados observa-se que é possível detectar a reatividade com as proteínas recombinantes pelos soros de pacientes com leptospirose acima da diluição 1:400 (diluição utilizada no experimento anterior) para os indivíduos correspondentes à fase convalescente da doença.
4.13 Avaliação de reação cruzada dos anticorpos IgG humanos de soro de pacientes com