A Genotipagem foi realizada utilizando o sistema Bio Apply 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A análise começou com o isolamento do RNA HIV-1, utilizando o kit de Purificação de RNA da QIAGEN - QIAamp UltraSens Virus Kit, Cat. No 53704, que envolve
basicamente a centrifugação em alta velocidade do plasma para liberação de partículas virais, lise destas com um agente caotrópico para liberação do RNA viral, e precipitação com isopropanol-etanol para recuperação do RNA.
O Buffer AC contém isopropanol e os Buffers AR e AW1 contêm hidroclorito de guanidina. Buffer AC contem um reagente que forma complexos com ácidos nucleicos e estes complexos podem ser sedimentados por baixa força de centrifugação para formar uma película. Esta película poderá então ser resuspensa em um pequeno volume de buffer antes da purificação do ácido nucleico, permitindo alta eficiência e sensibilidade no isolamento deste.
O Buffer AC e o carreador RNA foram adicionados ao plasma, após um pequeno período de incubação; a amostra foi centrifugada em baixa velocidade para suspender os complexos de ácido nucleico. O sobrenadante foi descartado, e a película resuspensa em Buffer AR e proteinase K, incubada por 10 minutos a 40°C. As condições de ligação foram ajustadas pela adição de Buffer AB e o lisado aplicado a um tubo para centrifugação. Durante uma breve centrifugação, o RNA liga-se seletivamente a membrana QIAamp e os contaminantes passam por esta. Contaminantes residuais e inibidores enzimáticos são eficientemente removidos pela centrifugação em dois passos de lavagem, e os ácidos nucleicos virais puros são eluidos em Buffer AVE de baixa salinidade.
Esta tecnologia requer centrifugação de muito baixa velocidade. Os complexos de ácido nucleico são sedimentados por baixa força g (1200xg). Porém, pode não funcionar bem com amostras plasmáticas que contenham grande quantidade de lipídeos, reduzindo a recuperação de ácidos nucleicos destes. O que pode ter acontecido em amostras de pacientes com dislipidemia severa, tendo impedido o isolamento viral inicial.
Antes de iniciar os passos do procedimento, as amostras foram equilibradas a temperatura da sala; Buffers AB, AW1, e AW2 e Carreador RNA foram preparados de acordo com as instruções; Misturado Buffer AB com etanol invertendo 10 vezes o tubo, assegurando-se que o buffer viscoso seja completamente dissolvido; e equilibrado o Buffer AR a 60°C em banho de água quente.
Procedimento:
1. Pipetado 1 ml do plasma equilibrado a temperatura ambiente (15–25°C) em tubo de microcentrífuga de 2ml. Adicionado o plasma antes do Buffer AC. Se a amostra fosse menor que 1ml, ajustado para 1 ml acrescentando salina de buffer fosfato. Pelo menos 200µl de plasma foi processado. Certificado que a tampa do tubo de microcentrífuga não estava contaminado com plasma, evitando que RNases contidas no plasma degradassem o carreador RNA adicionado a tampa no passo seguinte.
2. Pipetado 5,6 ul da solução do carreador RNA na tampa do tubo. Pipetado 0,8ml Buffer AC no topo da amostra do tubo de microcentrifuga. Não misturar Buffer AC e carreador RNA juntos antes de adicioná-los a amostra, pois poderá levar a recuperação variável de RNA. Após Buffer AC ser adicionado ao plasma, RNAses são inativadas. Pipetado o controlador interno junto com o carreador RNA na tampa do tubo de microcentrifugado. Foi preparado um Master Mix com 0,5µl de controle interno para 5,6µl de carreador RNA, sendo pipetado ao todo 6,1µl do mix na tampa do tubo.
3. Fechada tampa e misturado inicialmente invertendo o tubo de microcentrifugado três vezes para garantir que o carreador RNA esteja completamente dissolvido na amostra e depois vortexiado por 10 segundos.
4. Incubado a temperatura ambiente (15–25°C) por 10 min. Uma incubação de 10min é suficiente para ótima recuperação de HIV, HCV e HBV. Não lisar amostras por mais de 15min. Centrifugada amostra a 1200 x g por 3 min. Este passo de centrifugação é um passo chave para o processo de purificação. Após a centrifugação, o supernadante estará claro (sem debris) e a pellet manterá seu
formato quando o tubo de centrifugado é invertido. A pellet estará descolorida, mas esta não afetará o tamanho ou qualidade do acido nucléico.
5. Removido e descartado completamente o supernadante. Após remover o supernadante, fechada tampa e vortexiado a amostra. Certificado que nenhum resquício de pellet permaneceu dentro da tampa do tubo.
6. Adicionado 300 µl de Buffer AR aquecido a 60°C e 20 µl de proteinase K. Para diminuir o número de passos de pipetagem foi preparado um máster mix com 3,3 ml de Buffer AR aquecido com 220 µl proteinase K (ambos incluíram acréscimo de 10% no volume para compensar erros de pipetagem). Misturado vortexiando por 10 segundos e adicionado 320 µl do master mix em cada amostra. Vortexiado até que a pellet estivesse completamente resuspensa. Depois incubado para permitir a digestão da proteinase K.
7. Incubado por 10 min a 40°C num aquecedor de bloco, vortexiando a amostra a cada 5min por 5 segundos. Centrifugado brevemente para remover as gotas dentro da tampa do tubo.
8. Adicionado 300 µl de Buffer AB, misturado por vortex, e centrifugado brevemente para remover as gotas que ficaram na tampa.
9. Cuidadosamente aplicado 700 µl do lisado a uma coluna QIAamp spin sem molhar a membrana de gel-sílica sobre um tubo coletor de 2ml. Fechada tampa e centrifugado a 3000–5000 x g por 1 min.
10. Colocada a coluna QIAamp spin em um novo tubo coletor de 2 ml e descartado o tubo contendo o filtrado. Cuidadosamente abriu-se a coluna QIAamp e foi adicionado 500 µl do Buffer AW1. Centrifugado a 6000 x g por 1 min.
11. Colocado a coluna QIAamp spin em um novo tubo coletor. Cuidadosamente abriu-se a coluna QIAamp spin e se adicionou 500 µl de Buffer AW2. Centrifugado a velocidade máxima (20.000 x g) por 3 min. Colocado a coluna QIAamp spin em um tubo coletor de 2 ml descartando o velho com o filtrado. Centrifugado em velocidade máxima por 1 minuto. Colocada coluna QIAamp spin em um novo tubo de microcentrifugado com 1,5 ml. Descartado o tubo contendo o filtrado. Cuidadosamente abriu-se a coluna QIAamp spin.
12. Para eluir ácidos nucléicos virais, cuidadosamente foi aplicado 30 µl de Buffer AVE à membrana da coluna. Centrifugado a 6000 x g por 1 min.
13. Repetida a eluição adicionando mais 30 µl de Buffer AVE e centrifugada a 6000 x g por 1 min. Os dois passos de eluição asseguram a máxima recuperação dos ácidos nucléicos virais.
4.4.5 Processo de Transcrição Reversa do RNA em DNA viral
As amostras foram coletadas de setembro/2006 a janeiro/2008. Os exames foram coletados no Laboratório do Hospital São José e levados imediatamente ao laboratório de Pesquisa da IBIMED-UFC.
Após o processo de isolamento do RNA viral, retirou-se uma alíquota de 5 microlitros do RNA resuspenso que foi utilizado para transcrição reversa com TR do vírus da leucemia murina Moloney (AMV TR), seguido por um outro Nested PCR com DNA polimerase da AmpliTaq (Empresa Applied Biosystems, Foster City, Calif.).
O PCR obteve um produto com DNA de aproximadamente 1,8 kb que foi realizado com o sistema de controle de contaminação Amperase uracil N-glicosilase para reduzir o risco de contaminação do PCR com produtos de reações de amplificações prévias, estes produtos foram purificados utilizando colunas giratórias e analisados por eletroforese de agarose gel antes do sequenciamento, comparando-se com controles positivos e negativos.
Os primers utilizados durante o processo de PCR-TR primers foram desenhados a partir do modelo de sequência do vírus pNL4-3 do Primer 396 a 245 (sequência de nucleotídeos do pNL4-3 de 7485 a 8403) (Figura 13). Nos anexos encontram-se o sequenciamento completo do vírus pNL4-3 (ANEXO A).
TAAACATGTGGCAGGAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCCTCCCATCAGTGGACAAATTAGATGTTCATCAAA TATTACTGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAACAACAATGGGTCCGAGATCTTCAGACCTGGAGGA GGCGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAG CACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGG GTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTG TCTGATATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAG TCTGGGGCATCAAACAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGG GATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCT CTGGAACAGATTTGGAATAACATGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATAC ACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGC AAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGC TTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTAT CGTTTCAGACCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCC
Figura 13 - Região do RRE sequenciada utilizando como modelo o vírus pNL4-3
A região do RRE encontra-se sublinhado e os primers identificados por negrito. Descrição dos primers utilizados para sequenciamento: 396 primer externo para leitura superior da fita -5’ TAA ACA TGT GGC AGG AAG TAG G 3’ (22mer), 1438 primer interno para leitura superior da fita -nt 7712-7733-5’ AAG GCA AAG AGA AGA GTG GTG C 3’ (22mer), 245 primer externo para leitura inferior da fita -5’ GGC CTG TCG GGT CCC CTC GGG 3’ (21mer), 1439 primer interno para leitura inferior da fita -nt 8018-8039-5’ GCA CAG CAG TGG TGC AAA TGA G 3’ (22mer).
Sistema Numérico da Posição no vírus HXB2 e localização na sequência do envelope do pNL4-3 (Figura 14).
5881 cctaaaactg cttgtaccaa ttgctattgt aaaaagtgtt gctttcattg ccaagtttgt 5941 ttcatgacaa aagccttagg catctcctat ggcaggaaga agcggagaca gcgacgaaga 6001 gctcatcaga acagtcagac tcatcaagct tctctatcaa agcagtaagt agtacatgta 6061 atgcaaccta taatagtagc aatagtagca ttagtagtag caataataat agcaatagtt 6121 gtgtggtcca tagtaatcat agaatatagg aaaatattaa gacaaagaaa aatagacagg 6181 ttaattgata gactaataga aagagcagaa gacagtggca atgagagtga aggagaagta 6241 tcagcacttg tggagatggg ggtggaaatg gggcaccatg ctccttggga tattgatgat 6301 ctgtagtgct acagaaaaat tgtgggtcac agtctattat ggggtacctg tgtggaagga 6361 agcaaccacc actctatttt gtgcatcaga tgctaaagca tatgatacag aggtacataa 6421 tgtttgggcc acacatgcct gtgtacccac agaccccaac ccacaagaag tagtattggt 6481 aaatgtgaca gaaaatttta acatgtggaa aaatgacatg gtagaacaga tgcatgagga 6541 tataatcagt ttatgggatc aaagcctaaa gccatgtgta aaattaaccc cactctgtgt 6601 tagtttaaag tgcactgatt tgaagaatga tactaatacc aatagtagta gcgggagaat 6661 gataatggag aaaggagaga taaaaaactg ctctttcaat atcagcacaa gcataagaga 6721 taaggtgcag aaagaatatg cattctttta taaacttgat atagtaccaa tagataatac 6781 cagctatagg ttgataagtt gtaacacctc agtcattaca caggcctgtc caaaggtatc 6841 ctttgagcca attcccatac attattgtgc cccggctggt tttgcgattc taaaatgtaa 6901 taataagacg ttcaatggaa caggaccatg tacaaatgtc agcacagtac aatgtacaca 6961 tggaatcagg ccagtagtat caactcaact gctgttaaat ggcagtctag cagaagaaga 7021 tgtagtaatt agatctgcca atttcacaga caatgctaaa accataatag tacagctgaa 7081 cacatctgta gaaattaatt gtacaagacc caacaacaat acaagaaaaa gtatccgtat 7141 ccagagggga ccagggagag catttgttac aataggaaaa ataggaaata tgagacaagc 7201 acattgtaac attagtagag caaaatggaa tgccacttta aaacagatag ctagcaaatt 7261 aagagaacaa tttggaaata ataaaacaat aatctttaag caatcctcag gaggggaccc 7321 agaaattgta acgcacagtt ttaattgtgg aggggaattt ttctactgta attcaacaca 7381 actgtttaat agtacttggt ttaatagtac ttggagtact gaagggtcaa ataacactga 7441 aggaagtgac acaatcacac tcccatgcag aataaaacaa tttataaaca tgtggcagga 7501 agtaggaaaa gcaatgtatg cccctcccat cagtggacaa attagatgtt catcaaatat
Env 6224 Gp120 6305 rev exon 2 5949-6044 396 Superior/Para frente
7561 tactgggctg ctattaacaa gagatggtgg taataacaac aatgggtccg agatcttcag 7621 acctggagga ggcgatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt 7681 aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtggtgcagagaga 7741 aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac 7801 tatgggctgc acgtcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt ctgatatagt 7861 gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac 7921 agtctggggc atcaaacagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat acctaaagga 7981 tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc 8101 ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc 8041 ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaataaca tgacctggat 8161 gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt 8221 gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt 8281 aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga atagagttag 8341 gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca atcccgaggg gacccgacag 8401 gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca ttcgattagt 8461 gaacggatcc ttagcactta tctgggacga tctgcggagc ctgtgcctct tcagctacca 8521 ccgcttgaga gacttactct tgattgtaac gaggattgtg gaacttctgg gacgcagggg 8581 gtgggaagcc ctcaaatatt ggtggaatct cctacagtat tggagtcagg aactaaagaa 8641 tagtgctgtt aacttgctca atgccacagc catagcagta gctgagggga cagatagggt 8701 tatagaagta ttacaagcag cttatagagc tattcgccac atacctagaa gaataagaca 8761 gggcttggaa aggattttgc tataagatgg gtggcaagtg gtcaaaaagt agtgtgattg
Figura 14 - Sequencia do Envelope e REV do vírus pNL4-3
Sequenciamento dos nucleotídeos com respectivas localizações dos primers utilizados, inicio e término do gene env, localização da região mutacional para o peptídeo T20 e RRE. 396: 7495 → 7516, 1438: 7722-7742, 1439: 8049 → 8029, 245: 8413 → 8393, gp41: 7758 →8795, RRE (7710 - 8061). Gp41 7745 T20 peptideo 7769 env fim 8785 rev exon 3 8369-8643 1438 Nested Superior/Para frente 1439 nested Inferior/Reverso
Protocolo RT PCR e NESTED PCR do RRE da gp41:
Utilizado nos Controles: tubo com RNA teste, tubo sem amostra de RNA e sem Transcriptase reversa, tubos com amostra de RNA mas sem Transcriptase Reversa (volumes completados com água para obter total de 50ul).
Condições de Ciclagem: 42o C por 1 hora, 95o C por 3 minutos, (95o C por 1 minuto, 58o C por 1 minuto, 72o C por 2 minutos) repetidos por 30 ciclos, 72o C por 10 minutos, parada em 4o C.
Mix da reação por tubo (1x):
10x PCR Buffer sem MgCl2 (Invitrogen) 5ul
50mM MgCl2 (Invitrogen) 1.5ul
DEPC tratado H2O 35.5ul
10mM dNTP 0.4ul
Taq Polimerase 0.125ul
AMV Transcriptase Reversa 0.2ul
RNAsin 0.25ul
PRIMER #1 (396) 1ul PRIMER #2 (245) 1ul
RNA Amostra 5ul
TOTAL VOLUME 50ul
Nested PCR
Mix da reação por tubo (1x):
10x PCR Buffer sem MgCl2 (Invitrogen) 10ul
50mM MgCl2 (Invitrogen) 3ul
H20 76.95ul
10mM dNTP 0.8ul
Taq Polimerase 0.25ul
PRIMER #1 (1438) 2ul
PRIMER #2 (1439) 2ul
cDNA da Reação prévia RT PCR 5ul
Condições de Ciclagem: 95o C por 2 minutos, (95o C for 1 minuto, 45o C por 1 minuto, 72o C por 2 minutos) repetidos por 30 ciclos, 72o C por 10 minutos, parada em 4o C.
4.4.6 Purificação dos produtos de PCR para sequenciamento do RRE
Após a realização das duas etapas de PCR foi realizada eletroforese das amostras para identificação da presença de DNA comparado ao Big Dye. Para sequenciar os produtos de PCR Amplificados foi necessário purificar o DNA, e remover os primers e outras impurezas do PCR. Foi utilizado o Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit para realizar a purificação. A faixa desejada de DNA foi retirada do gel de agarose e dissolvida em um tampão equilibrado. Utilizada centrifugação e isopropanol para purificação dos produtos de PCR para sequenciamento a seguir (Figura 15).
Figura 15 - Sequências de DNA do RRE após PCR
Realização de Eletroforese em gel de agarose para verificar a presença de DNA viral a ser purificado para posterior sequenciamento.
Utilizado o protocolo “QIAquick Gel Extraction Kit Protocol” que é capaz de extrair e purificar DNA de 70pb até 10kb de gel de agarose padrão ou “low-melt“ em tampão TAE ou TEB. Até 400mg de agarose poderão ser processados por coluna de centrifugação.
Todos os passos de centrifugação foram realizados a velocidade de 10.000xg (≅13.000rpm) em uma microcentrífuga comum de bancada. A cor amarela do tampão QG indica o pH aproximado de 7.5. O uso de Acetato de Sódio 3M pH 5.0 pode ser necessário.
Protocolo:
1. Retirado o fragmento de DNA do gel de agarose com um bisturi limpo.
2. Pesado o pedaço do gel em um tubo transparente. Adicionado 3 volumes de tampão QG para 1 volume do gel (gel>2% de agarose adicionado 6 volumes de tampão QG).
3. Incubado a 50ºC por 10 minutos (ou até que o pedaço tenha dissolvido completamente). Para ajudar a dissolver o gel, vortexiado o tubo a cada 2-3min durante a incubação até solubilizar toda agarose.
4. Depois que o gel dissolveu completamente, checado se a cor da mistura está amarela (similar ao tampão QG sem dissolver a agarose). Se a cor da mistura estivesse laranja ou violeta, adicionado 10µL de acetato de sódio 3M, pH 5,0 e misturado. A mistura se tornará amarelada.
5. Adicionado 1 volume do gel de isopropanol na amostra e misturado. Este passo aumenta o rendimento de fragmentos de DNA <500pb e >4kb. Para fragmentos de DNA entre 500pb e 4kb, a adição de isopropanol não tem efeito. Não centrifugada a amostra neste estágio.
6. Colocada a coluna QIAquick num tubo coletor de 2mL.
7. Aplicada a amostra na coluna QIAquick para a ligação do DNA e centrifugado por 1 min. O volume máximo do reservatório é 800µL. Para volumes maiores que este, centrifugado em duas etapas.
8. Descartado o líquido do tubo coletor e recolocada a coluna novamente no tubo. 9. Adicionado 0,5mL do tampão QG a coluna QIAquick e centrifugado por 1 min. 10. Lavado adicionando-se 0,75mL do tampão PE na coluna QIAquick e centrifugando por 1 min. Como o DNA será usado para aplicações sensíveis ao
sal, tal como sequenciamento, deixada em repouso a coluna por 2-5 min após a adição do tampão PE, antes da centrifugação.
11. Descartado o líquido do tubo coletor e centrifugada a coluna QIAquick por 1 minuto adicional a >10.000xg (aproximadamente 13.000rpm).
12. Colocada a coluna QIAquick em um tubo limpo de1,5mL.
13. Para eluir o DNA, adicionado 50µL do tampão EB (Tris 10mM, pH 8,5) no centro da membrana e centrifugado por 1 minuto. Alternativamente, para uma maior concentração de DNA, adicionado 30µL de tampão EB ao centro da membrana, deixando repousar por 1 minuto e então centrifugado por 1 minuto. Assegurar-se que o tampão EB seja dispensado exatamente no centro da membrana para que o DNA ligado seja completamente eluído. O volume médio do eluato é de 48µL para 50µL de tampão de eluição e 28µL para 30µL de EB. A eficiência da eluição é dependente do pH. A eficiência máxima é obtida em pH 7,0 – 8,5. Ao usar água, certificar-se que o pH esteja nesta faixa, e armazenar o DNA a –20oC, já que este pode se degradar na ausência de um agente tamponante. O DNA também pode ser eluído em TE (Tris 10mM, EDTA 1mM, pH 8,0), mas o EDTA presente pode inibir reações enzimáticas subsequentes.
4.4.7 Sequenciamento do RRE do genoma viral
Utilizados os produtos purificados de agarose gel para sequenciar uma região correspondente a 350bp da região do genoma que corresponde ao RRE. Foram acrescidos os primers 1438 e 1439, o DNA purificado do gel, e o ABI Big Dye 3.1 Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (terminator). A concentração de primers foi de 3–5 picomoles/µl, e de DNA template entre 50–125 nanogramos/µl. O programa do termociclador foi de 30 ciclos: desnaturação (95°C) por 60 segundos, reaquecimento (58°C) por 60 segundos, e extensão (72°C) por 120 segundos. Depois purificados os produtos usando uma mistura de Acetato de Sodio, EDTA e etanol. Colocadas as amostras no ABI 3100 Avant Genetic Analyzer, que possui um sistema automatizado de 4
capilares. Analisados os dados gerados com o ABI Genetic Analyzer software (Figura 16).
Figura 16 - Esquema de Genotipagem do HIV-1
Inicialmente, o RNA do HIV-1 é resuspenso e utilizado para transcrição reversa por técnica de PCR, obtendo um produto de DNA de 350bp. 1. O PCR obtem um produto com DNA de 350bp, 2. Incubação do DNA amplificado para processamento, 3. Controle de amplificação, 4. PCR é realizado com o sistema de controle de contaminação Amperase uracil N-glicosilase, 5. Produtos de PCR são purificados, utilizando colunas giratórias e analisados por eletroforese de agarose gel antes do sequenciamento, 6. Sequenciamento de DNA é realizado utilizando terminators premisturados com sete diferentes primers, 7. Identificação das mutações, 8. Imagem de eletroforese das mutações, 9. Dados sequenciais são, então, analisados, utilizando o sistema genotípico ViroSeq (Fonte: Imagens cedidas por Dr Jose Carlos, UFRJ).
Procedimento:
Pipetado 4µl da amostra do DNA em cada poço. Finalizando uma concentração de DNA entre 200 – 500 ng/ poço. Utilizado PGEM vector como controle de qualidade.
Adicionado 2µl de primer a cada poço. Finalizando uma concentração de primer entre 6-10 picomoles/poço.
Centrifugado rapidamente.
Misturada a solução nas seguintes proporções (por 96 poços):
Solução: Quantidade:
ABI BigDye 3.1 126.72 µl
Tampão de Sequenciar 422.4 µl
Água purificada 929.28 µl
Misturado bem.
Adicionado 14µl da solução em cada poço, dando um volume total de 20µl/poço. Colocada as amostras no termociclador, e iniciado o ciclo seguinte no total de 30: Desnaturação (95°C) por 60 segundos; Processamento (58°C) por 60 segundos e Extensão (72°C) por 120 segundos
Durante esse período preparada a solução para purificar os produtos (por 96 poços): Adicionado 263µl 3 M de acetato de sódio com ph 4.6, 263µl de 125mM EDTA e 7,35 ml de etanol a 95%. Misturado bem.
Após o término dos ciclos do termociclador, removidas as amostras. Adicionado 75µl de solução preparada em cada poço.
Fechada a tapa com fita de parafina. Invertida placa 6 vezes.
Incubada a temperatura ambiente por 15 minutos. Preparada a balança.
Centrifugada a 30000 x g por 30 minutos. Com cuidado removida a fita de parafina.
Invertida a placa em toalha de papel e deixado secar.
Com a placa invertida em uma toalha de papel nova, esta foi centrifugada a 185 x g por 1 minuto.
Adicionado 75µl de etanol a 70 % em cada poço. Colocada uma nova fita de parafina e misturado. Centrifugada a 20.000 x g por 15 minutos.
Com cuidado removida a fita.
Invertida a placa em uma toalha de papel, e deixado secar.
Com a placa invertida em uma toalha de papel nova, foi centrifugada a 185 x g por 1 minuto.
Secada a placa no “hood” por 15 minutos Adicionado 30µl de Formamida. Misturado.
Desnaturada a 95o C por 3 minutos e colocada em gelo. Incubada por 3 minutos.
Centrifugada rapidamente.
Colocada no ABI 3100 Avant Genetic Analyzer e iniciado sequenciamento. O processamento total da amostra teve duração de aproximadamente 24 horas.
4.4.8 Avaliação do sequenciamento do RRE das amostras processadas
Após os resultados do sequenciamento, as amostras salvas em arquivo fasta foram colocadas para análise no site de Los Alamos, onde as sequências foram alinhadas tendo como referência o vírus Francês B.FR.83.HXB2 acesso K03455 do autor Van Beveren C.P. (WEISS et al., 1985). Os vírus sequenciados também foram comparados com
amostras de outros vírus europeus, americanos e brasileiros com sequências de RRE disponíveis no site de Los Alamos no período de julho a dezembro de 2010.
Os vírus de origem francesa, representando a população européia, utilizados para comparação foram: B.FR.x.1B6, B.FR.x.1F8, B.FR.x.1H6, B.FR.x.WT2, B.FR.x.LAIESC, B.FR.x.WT1, B.FR.92.PHI120, B.FR.95.PIH374, B.FR.95.PIH373, B.FR.93.PIH155, B.FR.93.PHI159, B.FR.85.NL43E9, B.FR.x.IIIB8X, B.FR.83.IIIBX, B.FR.94.PIH309, B.FR.93.PHI146, B.FR.93.PHI153, B.FR.x.CHA, B.FR.93.PIH160, B.FR.96.PIH384, B.FR.92.PHI133 ; os norte americanos foram: B.US.89.SFMHS20, B.US.x.MN, B.US.85.SFMHS11, B.US.88.SFMHS19, B.US.x.499JC16, B.US.x.NC7, B.US.85.SFMHS3, B.US.86.SFMHS17, B.US.91.DH12_5, B.US.91.DH12_3, B.US.86.SFMHS2, B.US.86.SFMHS8, B.US.87.SFMHS5, B.US.86.SFMHS18, B.US.86.SFMHS4, B.US.88.SFMHS6, B.US.87.SFMHS7, B.US.86.SFMHS1, B.US.86.SFMHS16, B.US.87.SFMHS9, B.US.85.SFMHS21; os brasileiros foram: B.BR.02.02BR013, B.BR.96.96BRRJ101, B.BR.98.98BRRS006, B.BR.03.BREPM2012, B.BR.x.BrRG97_126, B.BR.89.BZ167, B.BR.89.89BZ_167, B.BR.03.BREPM1032, B.BR.95.95BRRJ020, B.BR.95.95BRRJ013, B.BR.95.95BRRJ016, B.BR.95.95BRRJ017, B.BR.98.98BRRS004, B.BR.95.95BRRJ015, B.BR.95.95BRRJ012, B.BR.03.BREPM1028, B.BR.02.02BR011, B.BR.95.95BRRJ008, B.BR.03.BREPM1027, B.BR.02.02BR008, B.BR.03.BREPM1035, B.BR.95.95BRRJ011, B.BR.03.BREPM1033, B.BR.03.BREPM1040, B.BR.x.BrRJ96_042, B.BR.x.BrRJ96_002, B.BR.95.95BRSP001, B.BR.02.02BR002, B.BR.95.95BRRJ019, B.BR.x.95BRRJ002, B.BR.95.95BRRJ009, B.BR.x.BrRJ96_011, B.BR.03.BREPM1038, B.BR.03.BREPM1024, B.BR.95.95BRSP004, B.BR.95.95BRRJ005, B.BR.x.VLGC_B3, B.BR.x.BrRJ96_092, B.BR.92.92BR021, B.BR.x.BrRJ96_007, B.BR.x.BrRJ96_070, B.BR.x.437895, B.BR.x.607000236, B.BR.95.95BRRJ006, B.BR.x.BrRJ96_004,
B.BR.x.BrRJ96_041, B.BR.x.VLGC_B1; os argentinos foram: B.AR.99.ARMA132, B.AR.04.04AR151263, B.AR.00.ARMS008, B.AR.03.03AR137681, B.AR.04.04AR143170, B.AR.03.03AR138910, B.AR.98.ARCH054, B.AR.02.02AR114146 e B.AR.04.04AR151516. Os vírus utilizados para comparação de outros subtipos não B foram : A1.KE.94.Q23_17_ACC_AF004885, A1.SE.94.SE7253_ACC_AF069670, A1.UG.92.92UG037_ACC_U51190, A1.UG.98.98UG57136_ACC_AF484509, A2.CD.97.97CDKTB48_ACC_AF286238,A2.CY.94.94CY017_41_ACC_ AF28623, C.BR.92.BR025-d_ACC_U52953,