3.2.4.1. Diâmetro médio e índice de polidispersão
O diâmetro médio e o índice de polidispersão (IP) das nanoesferas e das nanocápsulas foram determinados por espectroscopia de correlação fotónica (Photon Correlation Spectroscopy - PCS), usando os aparelhos da marca Malvern, Zetasizer 3000 ou Zetasizer 5000 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido).
Esta técnica permite a determinação do diâmetro de partículas com dimensões compreendidas entre 5 nm e aproximadamente 5 μm. Em síntese, a técnica consiste em fazer incidir uma radiação laser na amostra, a uma dada temperatura, e em monitorizar a variação resultante da difracção da luz provocada pelos movimentos das partículas em suspensão. Esta variação é dependente da dimensão das partículas, sendo tanto mais rápida quanto menor for a sua dimensão (Müller, 1991; Barbosa, 1995).
A análise da variação da intensidade da luz difractada, em função do tempo, através de um autocorrelacionador, permite determinar o coeficiente de difusão das partículas (D), sendo então a dimensão das partículas calculada através da equação de Stokes-Einstein (McConnel, 1981; DeJaeger et al., 1991):
d T k D B πη = 3
kB é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta, η é a viscosidade do meio e d é o diâmetro de partícula.
O IP representa uma medida da amplitude das dimensões das partículas, podendo variar entre 0,0 e 1,0. A sua determinação é efectuada através de uma aplicação informática
específica. Populações de partículas com valores de IP compreendidos entre 0,03 e 0,08 são consideradas monodispersas, enquanto aquelas com uma distribuição estreita ou média de tamanho apresentam IP compreendidos entre 0,1 e 0,2 e 0,2 e 0,5, respectivamente. Valores de IP superiors a 0,5 indicam uma distribuição muito alargada do diâmetro de partículas (Müller, 1991).
As amostras foram analisadas à temperatura de 25ºC, após diluição adequada com água purificada (previamente desgaseificada e filtrada por uma membrana com 0,22 μm de porosidade), de modo a obter a concentração de partículas exigida pelo aparelho.
3.2.4.2. Potencial zeta
O potencial zeta das nanoesferas e das nanocápsulas foi determinado através da técnica
denominada Laser Doppler Anemometry (também designada Laser Doppler
Electrophoresis), utilizando os aparelhos Zetasizer 3000 ou Zetasizer 5000 (Malvern Instruments, Malvern, UK). A técnica consiste em fazer incidir dois feixes de radiação laser na amostra, registando-se a dispersão da luz provocada pelos movimentos das partículas submetidas a um campo eléctrico.
A análise da luz difractada permite a determinação da mobilidade electroforética das partículas, sendo o potencial zeta (ζ) calculado através da equação de Smoluchowski (Müller, 1991; Calvo, 1995):
ζ=Uη/ε
sendo U a mobilidade electroforética e η a viscosidade do meio. ε é definido por ε=ε0D, sendo ε0 a constante dieléctrica do vácuo e D a constante dieléctrica da água.
3.2.4.3. Quantificação das xantonas incorporadas nas nanoesferas
A XAN e a 3-MeOXAN incorporadas nas nanoesferas foram quantificadas com base num método de espectrofotometria de UV, previamente desenvolvido e validado de acordo com a USP 25e com as normas da ICH, no que se refere à especificidade, linearidade, exactidão e precisão (Anexo IV, pág. 243-245). Basicamente, este método foi sujeito a uma modificação que consistiu na determinação da concentração das xantonas após dissolução em acetonitrilo de alíquotas das respectivas dispersões aquosas de nanoesferas. De igual modo, as soluções padrão (com concentrações de 0,25; 0,50; 1,0; 2,0 e 3,0 μg/ml) foram obtidas por diluição em acetonitrilo de soluções mãe de XAN ou de 3-MeOXAN, ambas na concentração de 50 μg/ml. Com base nos valores de absorvência correspondentes a cada solução padrão, determinadas no comprimento de onda de 237 nm (espectrofotómetro Shimadzu UV 1603, Shimadzu Co., Kyoto, Japão) procedeu-se à construção de curvas de calibração. A concentração das xantonas nas amostras foi obtida por interpolação do respectivo valor de absorvência na curva de calibração correspondente.
A eficácia de incorporação (EI) foi calculada através da seguinte fórmula:
EI (%) = A/B x 100
A é a concentração de composto na dispersão de nanoesferas (μg/ml) e B é a concentração teórica (μg/ml).
3.2.4.4. Quantificação das xantonas incorporadas nas nanocápsulas
A XAN e a 3-MeOXAN incorporadas nas nanocápsulas foram quantificadas através de um método de HPLC, previamente desenvolvido e validado de acordo com a USP 25 e com as normas da ICH, no que se refere à especificidade, linearidade, exactidão e precisão (Anexo I, pág. 203-207). A concentração das xantonas foi determinada após dissolução em acetonitrilo de alíquotas das respectivas dispersões aquosas de nanocápsulas. O equipamento utilizado foi um cromatógrafo líquido de alta resolução equipado com uma bomba Jasco 880-PU (Tóquio, Japão) e um detector espectrofotométrico Jasco 875-UV (Tóquio, Japão). A separação foi efectuada numa coluna RP-18 (Nucleosil C18; 5 μm; 250x4,6 mm d.i.; Macherey-Nagel, Alemanha) e a análise cromatográfica foi realizada por eluição isocrática. A fase móvel utilizada era constituída por uma mistura de metanol:água (90:10, V/V). O fluxo da fase móvel foi optimizado em 1 ml/min e a detecção da XAN e da 3-MeOXAN foi realizada no comprimento de onda de 237 nm.
A eficácia de incorporação foi calculada com base na fórmula anteriormente descrita para as nanoesferas.
3.2.4.5. Calorimetria diferencial de varrimento
A calorimetria diferencial de varrimento (DSC) é uma técnica de análise térmica que mede a energia calorífica absorvida ou libertada durante o aquecimento ou arrefecimento de uma substância, em relação a uma amostra de referência. Estas medidas fornecem dados qualitativos e quantitativos de processos endotérmicos e exotérmicos permitindo obter informações referentes a alterações de propriedades físicas e/ou químicas, como, por exemplo, temperaturas de fusão, cristalização e transição vítrea (Ford e Timmins, 1989; Casimiro et al., 2005).
Esta técnica foi utilizada para caracterizar o estado físico da XAN e da 3-MeOXAN nas nanopartículas e para elucidar a existência de eventuais interacções entre as xantonas e o polímero. Os termogramas foram obtidos utilizando um calorímetro Shimadzu DSC-50 (Shimadzu Co., Kyoto, Japão). O intervalo de temperaturas de varrimento estava compreendido entre 25 e 300ºC e a velocidade de aquecimento foi fixada em 10ºC/min.
3.2.4.6. Morfologia
A morfologia das nanopartículas foi avaliada por microscopia electrónica de transmisssão (Transmission Electron Microscopy – TEM), utilizando um microscópio Zeiss M10C (Nova Iorque, EUA). A preparação da amostra para observação por microscopia requer a coloração com compostos de metais pesados, os quais permanecem no exterior do material a observar, denominando-se coloração negativa. As nanoesferas foram coradas com uma solução de acetato de uranilo a 1% (m/V) ou de ácido fosfotúngstico a 2% (m/V).