Utviklingstrekk i norsk og internasjonal verdipapirhandel .1 Innledning

7.2.2.1. Imunoensaios de captura de coproantigénios

Os antigénios de Giardia e Cryptosporidium que são excretados nas fezes, podem ser detetados através de ensaios imunoenzimáticos, nomeadamente ELISA (do inglês, Enzyme- Linked Immunosorbent Assay), ou através de imunocromatografia (IC) (CFSPH, 2012). Estes testes utilizam anticorpos monoclonais direcionados contra proteínas específicas da parede dos quistos e trofozoítos de Giardia duodenalis e dos oocistos de Cryptosporidium spp. (Papini & Cardini, 2006).

A técnica de ELISA permite obter, para além de um resultado qualitativo, um resultado quantitativo através das densidades óticas obtidas, e permite analisar várias amostras em lote. É um método que requer pelo menos uma hora para gerar os resultados, requer material e equipamento dispendioso e pessoal treinado, sendo mais adequada a sua utilização em laboratórios especializados (Papini et al., 2013; Van den Bossche et al., 2015).

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Comparativamente à microscopia, tem um custo mais elevado, mas aumenta a eficiência operacional e do diagnóstico, pois permite a análise de várias amostras no mesmo dia e com uma performance superior, quando é realizada uma única amostragem (Soares & Tasca, 2016). Os valores de sensibilidade e especificidade desta técnica para a deteção de Giardia apresentados na literatura, são de 51 a 100% e de 87 a 99%, respetivamente (Mekaru et al., 2007; Rimhanen-Finne, Enemark, Kolehmainen, Toropainen, & Hänninen, 2007; Rishniw et al., 2010; Uchôa et al., 2018; Uehlinger et al., 2017). Relativamente a Cryptosporidium, os valores apresentados são de 71% para a sensibilidade e de 94 a 97% para a especificidade (Mekaru et al., 2007; Rimhanen-Finne et al., 2007).

Por outro lado, os testes de imunocromatografia estão disponíveis sob a forma de testes de diagnóstico rápido e possibilitam a análise de uma única amostra. Estes não requerem equipamento especializado nem pessoal com treino ou experiência específicos, pois são testes de rápida e fácil preparação e interpretação (Ballweber et al., 2010; Pitães & Carvalho, 2016; Soares & Tasca, 2016). Os valores de sensibilidade e especificidade desta técnica para a deteção de Giardia apresentados na literatura, são de 52 a 96% e de 92 a 100%, respetivamente (Dryden et al., 2006; Geurden, Berkvens, Casaert, Vercruysse, & Claerebout, 2008; Mekaru et al., 2007; Papini & Cardini, 2006; Papini et al., 2013; Rishniw et al., 2010; Uchôa et al., 2018; Uehlinger et al., 2017). Já para Cryptosporidium, os valores apresentados são de 43 a 71% para a sensibilidade e de 90 a 99% para a especificidade (Mekaru et al., 2007).

Ambas as técnicas permitem utilizar amostras congeladas, ao contrário da microscopia. A maioria dos imunoensaios disponíveis no mercado também permite a utilização de amostras conservadas (Chalmers & Katzer, 2013; Soares & Tasca, 2016).

A maioria dos estudos publicados demonstra que os imunoensaios apresentam uma maior sensibilidade que a microscopia convencional. No entanto, outros autores reportaram sensibilidades semelhantes entre os dois métodos, quando procediam a duas ou três flutuações centrífugas com sulfato de zinco consecutivas (Decock et al., 2003; Uchôa et al., 2018; Uehlinger et al., 2017).

Estes testes podem apresentar resultados falso-positivos devido à excreção antigénica que pode persistir durante semanas a meses após a eliminação do parasita ou devido a reatividade cruzada com outros antigénios fecais. Contrariamente, podem gerar-se resultados falsos-negativos nos casos em que se utiliza a formalina na conservação das amostras, ou quando a concentração antigénica está abaixo dos limites de deteção dos testes, o que se pensa que pode acontecer em animais com infeção crónica subclínica (Koehler et al., 2014; Rishniw et al., 2010). Uma vez que a excreção antigénica é independente e anterior à excreção dos quistos, estes testes permitem a deteção de infeções pré-patentes e de infeções em que os quistos presentes estão em número muito reduzido ou mesmo não intactos, sendo

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mais sensíveis que a microscopia também nestes casos (Koehler et al., 2014; Uchôa et al., 2018).

A utilização de testes comerciais desenvolvidos para a medicina humana pode originar resultados falsos-negativos devido às diferenças antigénicas entre os diversos isolados (Mekaru et al., 2007; Papini & Cardini, 2006; Uehlinger et al., 2017). Atualmente, estão disponíveis no mercado testes comercias validados e aprovados para a deteção de coproantigénios dos dois protozoários em amostras de fezes caninas (ESCCAP, 2018). O mesmo teste pode detetar apenas um ou os dois parasitas ao mesmo tempo, apresentando os testes duplos uma menor sensibilidade e especificidade (Mekaru et al., 2007).

7.2.2.2. Imunofluorescência direta

Esta técnica baseia-se na utilização de anticorpos monoclonais, marcados com isotiocianato de fluoresceína, que reconhecem os epitopos da parede dos quistos de Giardia e dos oocistos de Cryptosporidium (Koehler et al., 2014). Estes anticorpos emitem fluorescência quando excitados num comprimento de onda específico, tornando visíveis os quistos e oocistos com uma fluorescência verde-maçã. Para tal, é necessário um microscópio de fluorescência com um filtro azul com um comprimento de onda de 450 nm (ESCCAP, 2018; Uehlinger et al., 2017). Como ambos os parasitas estão associados a diarreia do intestino delgado e/ou pode haver uma coinfeção, vários testes comerciais que detetam simultaneamente Cryptosporidium spp. e Giardia spp. estão disponíveis no mercado (Scorza & Lappin, 2012).

Apesar do processamento das amostras ser mais moroso do que na microscopia convencional, a análise em si é mais rápida e não requer um nível experiência elevado, uma vez que os quistos e oocistos são facilmente identificados pela sua morfologia e fluorescência. No entanto, a necessidade de equipamento especializado e o elevado custo dos testes comerciais, inviabilizam a sua utilização no diagnóstico clínico de rotina (Scorza & Lappin, 2012; Uehlinger et al., 2017). Relativamente às amostras, quando estas não podem ser imediatamente processadas ou têm de ser expedidas, estas podem ser armazenadas a uma temperatura de 4ºC durante alguns dias, não devendo ser congeladas (Scorza & Lappin, 2012).

A maior parte da literatura tem demonstrado que esta técnica tem uma performance superior à microscopia convencional (Gotfred-Rasmussen et al., 2016), nomeadamente à flutuação após centrifugação com sulfato de zinco, e também aos imunoensaios (Geurden et al., 2008; Rishniw et al., 2010; Uehlinger et al., 2017), atingindo uma elevada sensibilidade e especificidade, com valores de 91 a 100% e de 95 a 100%, respetivamente (Chako et al., 2010; Chalmers et al., 2011; Santos, 2016; Uiterwijk et al., 2018). Em relação à sensibilidade deste método na deteção de Cryptosporidium, comparativamente às técnicas de coloração, existe alguma controvérsia, uma vez que alguns autores demonstram que é um método mais

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sensível, enquanto que outros encontram sensibilidades idênticas para ambas as técnicas (Chalmers et al., 2011; Griffiths, 1998; Manser et al., 2014).

Para além da sua elevada performance, este teste permite obter tanto uma confirmação imunológica, como uma avaliação morfológica, reduzindo assim o risco de falsos-positivos (Scorza & Lappin, 2012). Vários autores e vários laboratórios especializados passaram a adotar esta técnica como gold standard e como primeira linha de diagnóstico na deteção de quistos de Giardia e de oocistos de Cryptosporidium (ESCCAP, 2018; Mirhashemi et al., 2015; Rishniw et al., 2010; CFSPH, 2012).

Relativamente a Cryptosporidium, a intensidade da fluorescência dos oocistos pode variar devido à variação antigénica entre os vários isolados da mesma espécie ou quando há infeções mistas na mesma amostra (Scorza & Lappin, 2012).