A análise da capacidade de ligação das proteínas a seqüências específicas de DNA foi realizada através do ensaio de retardamento em gel ou EMSA. Este ensaio baseia-se na detecção de uma proteína ligadora de DNA que reconhece especificamente uma seqüência que pode ser importante no controle da expressão de um gene em uma condição particular. A detecção das proteínas que se ligam ao DNA é baseada no efeito que essas proteínas causam na migração do DNA em um campo elétrico quando ligada a ele. O fragmento de DNA é marcado radiativamente e misturado ao extrato celular. As proteínas ligadoras de DNA irão retardar a migração do fragmento de DNA no gel quando submetido a um campo elétrico e o complexo DNA-proteína será detectado pela auto-radiografia. Neste ensaio, a proteína recombinante purificada também pode ser usada para a detecção de complexos DNA-proteína.
A análise da região promotora do gene gsn, realizada no laboratório, mostrou a existência de dois possíveis motifs de ligação de DNA (5’-TCAC-3’) reconhecidos pela proteína SRE1 de S. pombe (HUGHES; TODD; ESPENSHADE, 2005) nas posições -1758 e -2024
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Figura 28 - Purificação da proteína His-FLBC produzida em E. coli em grande escala. (A)
Perfil de eluição da proteína recombinante. As setas apontam as frações pares analisadas em gel (de 2 a 32). (B) Análise das frações da cromatografia em SDS-PAGE 12%. A seta indica as bandas correspondentes à proteína recombinante com aproximadamente 41 KDa. Os números à esquerda do gel expressam os Pesos Moleculares aproximados das proteínas em kDa.
A
B
PM FT 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 97 66 45 31 21 14___________________________________________________________________R esultados e D iscussão
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Figura 29 - Purificação da proteína GST-FLBC produzida em E. coli em grande escala. (A)
Perfil de eluição da proteína recombinante. (B) Análise das frações da cromatografia em SDS- PAGE 12%. A seta indica as bandas correspondentes à proteína recombinante com aproximadamente 66 kDa. Os números à esquerda do gel expressam os Pesos Moleculares aproximados das proteínas em kDa.
PM 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 97 45 31 21 66
A
B
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Figura 30- Purificação da proteína His-1629 produzida em E. coli em grande escala. (A)
Perfil de eluição da proteína recombinante. (B) Análise das frações da cromatografia em SDS- PAGE 12%. A seta indica as bandas correspondentes à proteína recombinante com aproximadamente 47 kDa. Os números à esquerda do gel expressam os Pesos Moleculares aproximados das proteínas em kDa.
B
A
PM FT 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 97 66 45 31 21 14___________________________________________________________________R esultados e D iscussão
90 (GONÇALVES et al., 2011), como mostra a figura 31 e vários foram identificados no promotor gpn.
Para investigar a capacidade de ligação dessa proteína a seqüências de DNA no promotor do gene gsn, ensaios de EMSA foram realizados utilizando frações cromatográficas obtidas após fracionamento do extrato celular total em coluna de Heparina-Sepharose. O perfil de eluição está apresentado na figura 32A. A interação DNA-proteína foi analisada na presença de frações cromatográficas (50 μg) com uma sonda de DNA de 164 pb contendo motif SRE1, como mostrado no esquema da figura 32B. Os oligonucleotídeos utilizados para a amplificação do fragmento de DNA (tabela 4) foram desenhados de maneira a conservar um dos possíveis motifs de ligação SRE1 no promotor gsn. Foram analisadas as frações de 12 a 19 e os resultados do ensaio realizado mostraram que ocorreu a formação de complexos DNA- proteína, indicados pelas setas na figura 32B, a partir da fração 14, sugerindo a ligação de proteínas do extrato ao motif SRE1.
Com o objetivo de validar os resultados apresentados, a especificidade dos complexos formados foi verificada pela incubação dos extratos na presença do competidor específico sre1. Para o ensaio de competição, o mesmo fragmento de DNA usado como sonda foi adicionado sem marcação radiativa na reação e usado como competidor específico. As ligações das proteínas ao sítio sre1, após adição do competidor específico, mostraram a liberação parcial da sonda, em comparação ao perfil mostrado anteriormente. Embora a formação dos complexos DNA-proteína, observados nas frações de 16 a 17, não foi impedida pela adição prévia do competidor específico (10 X) (figura 33A, linhas 4 a 9) podemos observar uma redução na formação dos complexos quando o competidor estava presente. A figura 33B mostra o ensaio de EMSA realizado com a fração protéica 17 na presença de uma concentração maior de competidor específico em relação à sonda (20 X). Os resultados mostraram que, assim como ocorreu anteriormente no ensaio de competição, o aumento da concentração do competidor específico não impediu a formação do complexo, apesar de aumentar a capacidade de migração da sonda livre no gel. A observação dos resultados dos ensaios de EMSA do extrato total protéico com o fragmento de DNA contendo o motif SRE1 indicou que proteínas presentes no extrato se ligaram ao motif SRE1 do promotor gsn.
Estes ensaios são preliminares e outros ensaios deverão se repetidos para a confirmação da ligação, inclusive utilizando a proteína recombinante quando conseguirmos a mesma. Da mesma maneira, ensaios de competição tais como, uso de oligonucleotídeo dupla- fita como competidor, deverá ser realizado para a confirmação da especificidade da ligação.
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Figura 31- Representação esquemática da região 5’-flanqueadora dos genes gsn e gpn.
Posições relativas dos motifs de DNA reconhecidos pelos fatores de transcrição SRE1 e FLBC. A seqüência TATA-box no promotor gsn é indicada por T. A ORFs estão delimitadas pelo start e stop códon ATG e TAA. O Sitio de iniciação da transcrição (TIS) no promotor gsn é representado por uma seta. A posição dos elementos de DNA considera o codon ATG de iniciação da tradução.