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Após radiomarcação da SP(Nle11_{)-DOTA nas condições padrões extrapolando} a relação massa:atividade determinada como _{padrão (10 μg peptídeo : 148 MBq de} 177_{LuCl3) em 10 vezes, o que resultou na marcação de 100 μg do peptídeo com 1480} MBq (40,0 mCi), as preparações tiveram sua estabilidade in vitro no soro humano, sob refrigeração e no freezer analisadas por CCD e CLAE.

5.4.1.1 Análise da estabilidade sob refrigeração (2-8°C)

A estabilidade in vitro da SP(Nle11_{)-DOTA radiomarcada e armazenada sob} refrigeração foi avaliada através da determinação de sua pureza radioquímica por CCD e CLAE imediatamente após a marcação e após incubação de 24, 48, 72, 96, 120 e 168 horas sob refrigeração (2-8°C).

Pela análise da pureza radioquímica determinada por CCD observou-se uma alta pureza radioquímica (99,30 ± 0,29%) imediatamente após a marcação, porém após incubação sob refrigeração a pureza radiquímica diminui gradualmente e em apenas 24 horas já são observados valores abaixo do satisfatório (FIG. 16).

FIGURA 16 - Pureza radioquímica da SP(Nle11_)-DOTA-177_{Lu determinada por CCD após marcação}

com alta atividade e incubação sob refrigeração (2-8°C) por até 168 horas.

A análise dos cromatogramas apresentados na FIG. 17 confirma a baixa estabilidade sob refrigeração da SP(Nle11_{)-DOTA radiomarcada com alta atividade.}

Na FIG. 17-A são observados dois picos, um pequeno pico com TR = 2,80 minutos referente ao 177_{Lu livre e um outro com uma área bem maior e um TR =} 11,45 minutos referente a SP(Nle11_{)-DOTA radiomarcada, isso evidencia a alta} pureza radioquímica obtida pela marcação.

Após 24 horas de incubação sob refrigeração (FIG. 17-B), observa-se um aumento significativo do pico referente ao 177_{Lu livre (TR = 2,80 minutos) e o}

surgimento de um novo pico, mais largo, com um TR = 10,90 minutos provavelmente referente à SP(Nle11_)-DOTA-177_{Lu degradada indicando assim uma baixa} estabilidade desse radiofármaco quando armazenado sob refrigeração.

Análises realizadas após tempos de armazenamento maiores mostram um aumento gradual no pico referente ao lutécio-177 livre e uma diminuição no pico referente à SP(Nle11_{)-DOTA, sendo que após sete dias de incubação o pico} referente à SP(Nle11_{)-DOTA radiomarcada não é mais observado (FIG. 17-G).}

FIGURA 17 - Perfil de CLAE (radioativo; coluna C18 200 mm x 4,60 mm, 5 µm; fluxo 1,0 mL/min) da

SP(Nle11_)-DOTA-177_{Lu imediatamente após marcação com alta atividade (A) e 24 horas (B), 48 horas}

(C), 72 horas (D), 96 horas (E), 120 horas (F) e 168 horas (G) após incubação sob refrigeração (2- 8°C).

Essa baixa estabilidade do produto marcado com alta atividade é explicada pela radiólise (formação de radicais livres reativos para peptídeos) que pode ser evitada através do uso de agentes estabilizantes e do congelamento da amostra.

5.4.1.2 Análise da estabilidade em freezer (-20°C)

A SP(Nle11_{)-DOTA radiomarcada com alta atividade teve sua estabilidade in} vitro avaliada após incubação de até 48 horas em freezer (-20°C).

As purezas radioquímicas determinadas imediatamente após a marcação e após incubação de 24 e 48 horas são apresentadas na FIG. 18 e demonstram uma boa estabilidade do radiofármaco quando armazenado no freezer por até dois dias.

FIGURA 18 - Pureza radioquímica da SP(Nle11_)-DOTA-177_{Lu determinada por CCD após marcação}

com alta atividade e incubação em freezer (-20°C) por até 48 horas.

Essa boa estabilidade do radiofármaco no freezer foi confirmada pela análise por CLAE. O cromatograma obtido imediatamente após a marcação (FIG. 19-A) apresenta um pequeno pico referente ao 177_{Lu livre (TR = 2,80 minutos) e um pico} mais significativo referente à SP(Nle11_{)-DOTA. Após 24 horas de armazenamento no} freezer (FIG. 19-B) observa-se um pequeno aumento do pico referente ao lutécio- 177 livre e o surgimento de um terceiro pico com TR = 10,90 minutos referente a SP (Nle11_)-DOTA-177_{Lu degradada, porém o pico referente ao radiofármaco intacto (TR =} 11,45 minutos) continua predominante confirmando assim os resultados obtidos por CCD.

FIGURA 19 - Perfil de CLAE (radioativo; coluna C18 200 mm x 4,60 mm, 5 µm; fluxo 1,0 mL/min) da

SP(Nle11_)-DOTA-177_{Lu imediatamente após marcação com alta atividade (A) e 24 horas após}

incubação em freezer (B).

Esses resultados indicam que o armazenamento do radiofármaco no freezer (-20°C) após marcação com alta atividade é um método efetivo para obtenção de uma maior estabilidade do produto, indicando que o congelamento da amostra tem um importante papel na prevenção da radiólise permitindo assim a utilização do radiofármaco em dia posterior a marcação.

Este estudo é de extrema importância para definição das condições a serem utilizadas para o transporte do radiofármaco, quando considera-se a possibilidade de aplicação clínica deste composto radiomarcado. Desta forma, o produto poderia ser comercializado, uma vez que o transporte na forma congelada pode ser realizado, sendo uma prática comum aos radiofármacos baseados em proteínas atualmente comercializados pelo IPEN.

5.4.1.3 Análise da estabilidade em soro humano a 37°C

A estabilidade da SP(Nle11_)-DOTA-177_{Lu em soro humano foi avaliada pela} determinação de sua pureza radioquímica, por CCD, imediatamente após a marcação e após 1, 4 e 24 horas de incubação no soro a 37°C.

Os resultados apresentados na FIG. 20 mostram uma estabilidade satisfatória do radiofármaco em soro humano em até 24 horas após radiomarcação indicando uma boa estabilidade metabólica da SP(Nle11_)-DOTA-177_Lu.

FIGURA 20 - Pureza radioquímica da SP(Nle11_)-DOTA-177_{Lu determinada por CCD após marcação}

com alta atividade e após incubação em soro humano à 37°C por 1, 4 e 24 horas.

Essa boa estabilidade metabólica é uma propriedade importante do radiofármaco para garantir assim sua permanência no local de administração na forma íntegra (terapia por administração intratumoral ou intracavitária) e o seu potencial para interação com os receptores das células tumorais.

Porém, a alta pureza radioquímica observada após 24 horas de incubação (99,15 ± 0,04%) associada a alta pureza radioquímica após 4 horas, chamam a atenção para uma possível falta de sensibilidade do sistema de CCD utilizado para determinação da estabilidade do radiofármaco em soro humano.

Nesse sistema, quando o pH do plasma está acima de 6,5, o 177_{Lu livre} formado, que normalmente se apresenta na forma de cátions (177_Lu+3_{), poderá} apresentar-se na forma de óxidos de lutécio insolúveis, que permanecem na origem da fita apresentando um TR semelhante ao do peptídeo radiomarcado, causando uma falsa impressão de alta pureza radioquímica.

5.4.2 Influência do uso de agentes estabilizantes na estabilidade in vitro da