Para maximizar o rendimento de uma extração cujo objetivo é a obtenção de taninos, existem várias premissas que devem ser observadas. No entanto, deve ter-se em atenção que nenhum método extrativo é totalmente eficaz, pois alguns taninos ligam-se irreversivelmente a outros polímeros celulares (38,52).
Quanto ao material vegetal utilizado, deve ser dada preferência ao uso de material fresco ou seco e pulverizado. Se possível o material deverá ser liofilizado (38,53).
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Em relação ao solvente preferido, existe alguma controvérsia, pois nenhum solvente é o ideal, devendo a escolha ser baseada num compromisso entre estabilidade e a capacidade extrativa. Ao debate acrescem as diferenças estruturais entre os vários tipos de taninos, o que condiciona a sua interação com o solvente e compromete a existência de um solvente ótimo (52).
Assim, o uso de soluções aquosas de acetona permite obter rendimentos superiores, mas com estabilidade diminuída (38,52). O uso do metanol, embora confira maior estabilidade ao extrato, pode provocar a metanólise dos taninos gálhicos (53). O solvente com melhor rendimento depende, ainda, das características da planta - e.g. na extração de taninos em folhas de Psidium Guajava L. o solvente mais indicado foi o etanol (54). Em relação à água, deve ter-se em conta que nas condições de decocção (água fervente), um tanino como a Gereninna decompõe-se em 30 min (53).
Quando a finalidade é o doseamento de taninos, deve ser feita uma extração em soxhlet da matéria vegetal pulverizada até ao esgotamento do solvente, sendo este habitualmente uma mistura de água:acetona (1:3) ou água:metanol (1:1) (45).
Pode ser necessário isolar os taninos do extrato bruto para melhorar a sensibilidade do doseamento, por meio de extração líquido-líquido ou por técnicas cromatográficas (38). Quando necessário, o diclorometano pode ser utilizado para eliminar lípidos e pigmentos em casos específicos (53).
3.3.2. Doseamento
O doseamento dos taninos é complexo: às dificuldades da extração acrescenta-se a falta de especificidade dos métodos disponíveis (38).
A técnica mais utilizada é a aplicação do método de Folin-Ciocalteu à pesquisa de taninos (55). Este método permite dosear a totalidade dos compostos fenólicos, incluindo nestes os taninos, baseando-se na capacidade redutora dos compostos fenólicos em geral (38,55).
Figura 4 – Método de Folin-Ciocalteu. O Ácido Gálhico, padrão mais utilizado de compostos fenólicos, forma o ião fenolato em meio básico, pelo Carbonato de Cálcio. O ião fenolato tem a capacidade de reduzir o molibdénio do reagente de Folin-Ciocalteu (Reagente Fosfomolibdotúngstico – cor amarela), convertendo-o num produto azul. A reação pode ser seguida por espectrofotometria e a quantidade de reagente reduzido formado é diretamente proporcional à quantidade de compostos fenólicos presentes. Adaptado de (66).
13 Após o doseamento da totalidade dos compostos fenólicos, os taninos são removidos do extrato, recorrendo à sua capacidade de precipitar as proteínas e compostos aminados. Por adição de Polivinilpolipirrolidona (PVPP), polímero que estabelece ligações semelhantes às peptídicas com taninos, os taninos precipitam e poderão ser removidos do extrato por centrifugação. No último passo volta a ser aplicado o método de Folin-Ciocalteu e são doseados os compostos fenólicos remanescentes. A diferença na quantidade de compostos fenólicos entre os 2 ensaios corresponderá aos taninos presentes no extrato que precipitaram.
Deste modo, em condições de ensaio otimizadas, o Método de Folin-Ciocalteu permite dosear os compostos fenólicos totais e os taninos totais de forma rápida e com pouco consumo de reagentes e extrato (55).
4. Objetivo
Este projeto propõe avaliar se a atividade antidiarreica associada à T. angustifolium tem fundamento a nível fitoquímico, através da pesquisa de taninos no decocto proveniente do método extrativo tradicional.
Para além deste objetivo, pretende-se conduzir várias extrações sob diferentes condições, que permitam uma análise preliminar de algumas condicionantes do processo extrativo, tais como: fracionamento da matéria vegetal; solvente de extração; temperatura de extração e fase de maturação da planta.
5. Materiais e métodos
5.1. Matéria vegetal
5.1.1. Colheita e preparação
Utilizaram-se as inflorescências completas, secas de Trifolium angustifolium L., em 3 fases distintas de crescimento:
1ª Fase – planta viva antes e durante o período de floração (abril-maio); 2ª Fase – planta viva após o período de floração (maio-junho);
3ª Fase – planta seca durante a libertação de sementes (junho-julho).
As partes aéreas de T. angustifolium (inflorescência, folhas e caules) foram colhidas em 3 momentos (inicio de maio, junho e julho de 2013) e em 2 localizações distintas (Évora e Covilhã), conforme o seu ritmo de crescimento. A sua identificação foi feita através das características botânicas mais distintivas (inflorescência cilíndrica característica e folhas esguias). Tentaram obter-se quantidades de cada fase suficientes para permitir todos os procedimentos subsequentes.
A matéria vegetal recolhida foi fracionada. Manteve-se a inflorescência e descartou-se o restante material vegetal, visto não ter uso na medicina tradicional (2,13–15). As inflorescências das Fases 1 e 2 foram secas em estufa ventilada a 30°C, durante 48h. O material correspondente à Fase 3 não passou por secagem - a planta surge naturalmente desidratada.
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Após a secagem, manteve-se cerca de 1/3 da massa de planta intacta e triturou-se o restante numa trituradora elétrica e através de crivagens, obteve-se um pó fino (1mm).
As amostras de inflorescência completa e pulverizada foram armazenadas ao abrigo da luz.
5.2. Reagentes e solventes
Foram utilizados como solventes água destilada, etanol puro e metanol puro. Com exceção da água destilada produzida internamente num sistema purificador de água, os restantes solventes foram adquiridos à Panreac®.
Como reagentes utilizou-se reagente de Folin-Ciocalteu 2N, carbonato de sódio (Na2CO3) e PVPP. Todos os regentes foram adquiridos à Sigma-Aldrich®.
5.3. Equipamentos
Para condução deste trabalho foi necessário utilizar: Estufa de ar quente (Raypa®), Rotavapor® Buchi R-215, Trituradora (Moulinex®), Estufa de vácuo e ar quente (Raypa®), Centrífuga (Mikro 200R - Hettich) e Espectrofotómetro UV-Vis (UV-1700 PharmaSpec - Shimadzu Corp.).