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Apesar dos fármacos contra o Trypanosoma cruzi serem poucos e falhos, as estratégias usadas no manejo clinico do cardiopata chagásico apresentam, atualmente, novas vertentes de investigação, por exemplo, a ação direta sobre a resposta imune do hospedeiro (Consenso brasileiro em doença de Chagas). Dentro dessa estratégia, podemos citar os fármacos que agem diretamente no sistema renina-angiotensina- aldosterona (RAAS) levando a uma modulação da resposta inflamatória por inibirem a liberação da aldosterona ou agirem indiretamente em vias secundárias como da bradicinina (Nishio et. al., 2011). Como exemplo de fármacos que agem no RAAS cita- se os inibidores da enzima conversora da angiotensina (ECA) e os bloqueadores do receptor da angiotensina II (BR da Angio II).
A primeira preocupação neste trabalho foi determinar uma dose adequada a ser utilizada nos tratamentos com o BR da Angio II (Losartan), com o inibidor da ECA (Enlapril) e a combinação entre ambos. Esses fármacos já são empregados em diversas dosagens para avaliação em quadros de cardiopatia, hipertensão, diabetes, dentre outros. Portanto nossa estratégia baseou-se em investigar, na literatura, as dosagens utilizadas desses fármacos e construir uma curva dose resposta avaliando-se parâmetros inerentes à infecção aguda pelo Trypanosoma cruzi. Em humanos, o Losartan é comumente utilizado na dose de 50mg/Kg/dia (Al-Thanoon & Mahmood, 2012), no entanto consideramos mais adequado investigar referências que utilizassem um modelo experimental semelhante ao nosso. A maioria das referências enfocando o tratamento com Losartan descrevia sua administração diluída em água (modelos experimentais), normalmente em concentração final próxima a 0,002g/animal/dia (Yang et. al., 2009; Campuzano et. al., 2012). Considerando que em 24 horas um camundongo consome diferentes quantidades de água e, conseqüentemente, diferentes quantidades do fármaco, optamos por utilizar um método de tratamento em que a dose individual diária seria constante e igual para todos os animais do mesmo grupo. Optou-se, dessa forma, pela utilização do método de gavagem diária, onde a curva dose-resposta foi estabelecida com as doses de 10, 15 e 20mg/Kg/dia (Senador et. al., 2009; Jessup et. al., 2009; van den Borne et. al., 2009; Okt et. al., 2012). Avaliou-se, em paralelo, a parasitemia e a sobrevida dos animas sendo a dose de escolha para o Losartan após estes experimentos foi 15mg/Kg/dia. Para o tratamento com Enalapril a curva dose-resposta foi elaborada com as doses 10, 15 e 25mg/Kg/dia (Knowles et. al., 2001; Xu et. al., 2002; Leuschner et. al., 2010; Paula-Costa et. al., 2010), sendo a dose de maior eficiência nos parâmetros
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avaliados aquele equivalente a 25mg/Kg/dia. Para a combinação procurou-se mesclar os pontos escolhidos para as monoterapias sem utilizar os valores máximos de cada uma.
O inibidor da ECA, Captopril, foi previamente estudado em modelo experimental da doença de Chagas não sendo capaz de promover a sobrevida dos camundongos e nem de alterar os níveis de parasitos circulantes e teciduais (Leon et. al., 2003). Estes resultados mostraram-se contrários aos achados neste presente estudo onde verificou-se uma redução no parasitismo sanguíneo e tecidual proporcionado pelo tratamento com o inibidor da ECA, Enalapril. Resultado semelhante já havia sido observado anteriormente por nosso grupo, quando o tratamento com Enalapril foi capaz de reduzir a carga parasitária circulante e tecidual, além de promover maior sobrevida aos animais. Além disso, mostrou-se uma ação anti-replicativa do Enalapril sobre a forma epimastigota do T. cruzi in vitro (Paula-Costa et al.,2010). A escassez de trabalhos relacionados ao tratamento com inibidores da ECA e a infecção experimental pelo T. cruzi dificulta uma explicação para a divergência observada entre os dois inibidores, sendo hipotetizado que a diferença na composição química (no caso a ausência de um grupamento “thiol” no Enalapril) seria responsável por essas divergências, já que esse grupamento desempenha, intracelularmente, importantes papéis em quase todos os aspectos das funções celulares como a participação de sua oxidação nas vias de toxicidade por oxigênio, na interferência na glicólise e na produção energética pelas mitocôndrias (Haugaard, 2000). De forma análoga, existe a dificuldade de se explicar as ações do Losartan no parasitismo tecidual e sanguíneo pela ausência de trabalhos correlacionando tratamentos com BR da Angio II e a infecção experimental pelo T. cruzi. A exemplo do Enalapril, o Losartan não apresenta o grupamento thiol em sua composição química, no entanto essa explicação não seria satisfatória por estarmos comparando fórmulas totalmente diferentes e levando a entender que qualquer composto com a ausência desse agrupamento seria prejudicial ao parasito. Um recente trabalho mostrou a ação anti-parasitária do tratamento com Losartan em infecção aguda causada pelo Schistosoma mansoni relacionando esta ação a interferências do fármaco sobre o sistema imune do hospedeiro (El-Lakkany et. al., 2011).
De fato, a inflamação é um mecanismo chave para a gênese e a progressão das lesões associadas à cardiopatia chagásica, onde a presença do T. cruzi ou de seus antígenos desencadeia uma resposta humoral/celular capaz não somente de destruir o agente infeccioso, mas também as células do hospedeiro. Neste trabalho, foram
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demonstrados que o Enalapril e o Losartan apresentam importantes propriedades anti- inflamatórias capazes de suprimir o recrutamento de leucócitos para o tecido cardíaco. Há uma redução evidente dos marcadores inflamatórios circulantes nos animais tratados com os fármacos que restringem as ações da Angio II, como a citocina pró-inflamatória TNF-alfa e a quimiocina CCL5/RANTES. Previamente, camundongos C57BL6 infectados com a cepa Colombiana do T. cruzi mostraram elevada expressão de IFN- gama coordenando a expressão de diferentes citocinas/quimicionas durante a fase aguda da doença de Chagas experimental, como por exemplo a TNF-alfa e a CCL5/RANTES (Talvani et. al., 2000). Esses dados embasaram nossos parâmetros biológicos sobre o recrutamento leucocitário para o tecido muscular cardíaco, bem como sobre o comportamento inflamatório induzido pela cepa Colombiana do T. cruzi. Também já foi amplamente demonstrado a importância do TNF-alfa durante a fase aguda da infecção (Tarleton, 1988), no entanto a presença desta citocina em tecido cardíaco durante a infecção pelo T. cruzi é relacionada a danos teciduais (Kroll-Palhares et. al., 2008). Além da participação da CCL5 na patologia observada durante a doença de Chagas, onde animais tratados com met-RANTES (competidor da CCL5) apresentaram redução no infiltrado inflamatório no coração e apresentaram maior sobrevida (Marino et al. 2004).
Outra quimiocina importante na atração de células para o sítio inflamatório, também relacionada à patogênese da doença de Chagas, seria a CCL2/MCP-1. Elevados níveis dessa quimiocina, juntamente com TNF-alfa leva a uma miocardite induzida pela infecção pelo T. cruzi mais severa e conseqüente disfunção cardíaca (Talvani et. al., 2004). Essa quimiocina ainda exerce interação com o parasito, podendo ter importante ação no tropismo tecidual (Yamauchi et. al., 2007). Portanto, uma vez que a resposta imune anti-T.cruzi culmina em um influxo leucocitário para o tecido cardíaco, novas intervenções farmacológicas com propriedades anti-inflamatórias poderiam trazer benefícios fisiopatológicos para o curso da doença.
Neste estudo observamos que o tratamento com o Losartan levou a uma redução dos níveis de CCL2 séricos, o que tomado junto com a redução nos níveis de TNF-alfa, CCL5 e a um aumento na concentração da citocina regulatória IL-10 culminou na redução da inflamação, evidenciado pela redução do infiltrado inflamatório no tecido muscular cardíaco acompanhado por uma tendência na redução do peso relativo desse tecido. Este mesmo tratamento com o Losartan durante a infecção
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apresentou ainda uma manutenção nos níveis plasmáticos de IL-17, o que contradiz o trabalho de Weber et. al. (2012) onde foi observado que o tratamento com BR da Angio II leva a uma redução de 4 vezes na concentração de IL-17.
O tratamento com o Enalapril também apresentou um interessante perfil no quadro geral apresentado pela resposta imunológica. Houve redução das citocinas pró- inflamatórias TNF-alfa e IL-17, além da quimiocina CCL5 resultando em redução na migração de células inflamatórias para o coração evidenciado por uma baixa no peso relativo do órgão. Esses dados corroboram com trabalhos onde houve tratamento da infecção experimental pelo T. cruzi com inibidores da ECA. Esse tratamento é capaz de reduzir a miocardite induzida pela infecção (Leon et. al, 2003) além de reduzir diversos marcadores inflamatórios proporcionando uma maior sobrevida aos animais (Paula- Costa et. al., 2010). Por outro lado, nosso dados corroboram com o trabalho de Weber et al. (2012), onde observamos que o tratamento com inibidor da ECA levou a redução de IL-17. Outro aspecto importante sobre esta citocina descrito para a doença de Chagas, mas em culturad de monócitos isolados de sangue humano, demonstrou uma elevação na produção de IL-17 por linfócitos T CD4+ (Coelho dos Santos et. al. 2010).
Em âmbitos gerais, sabemos que a resposta inflamatória durante a doença de Chagas é de grande importância no controle do parasito, entretanto sua persistência leva a danos teciduais, principalmente no coração (Talvani & Teixeira, 2011). Na interação inicial do parasito com as células do hospedeiro, haverá intensa liberação de marcadores inflamatórios como TNF-alfa, CCL2, CCL5 e óxido nítrico (Coelho et al. 2002, Talvani et. al., 2009). Essa resposta inicial é importante no controle do parasito estimulando migração de mais células inflamatórias para os tecidos infectados. Como essa resposta não é suficiente para eliminar o parasito, sua persistência será um estímulo para manutenção da inflamação, tornando-se um problema para o hospedeiro. A alta produção de quimiocinas levaria a um estimulo para evolução da forma cardíaca da doença (Guedes, 2010a) associado a uma baixa expressão de IL-10 que estará relacionada ao controle da resposta tipo Th1 (Costa et. al., 2009). Há ainda o papel da quimiocina IL-17 que está associada à proteção da miocardite causa pela infecção pelo
T. cruzi e exerce regulação sobre algumas quimiocina, dentre eleas CCL2 e CCL5
(Guedes et. al., 2010b). Dessa forma, os resultados apresentados neste trabalho mostram-se consistentes, uma vez que as monoterapias com Enalapril e Losartan apresentaram redução dos marcadores inflamatórios circulantes, do infiltrado
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inflamatório em tecido muscular cardíaco sem haver prejuízo no controle do parasitismo. Especificamente, o tratamento com o Losartan mostrou um aumento da produção de citocina regulatória, uma redução do TNF-alfa e uma elevada produção da citocina IL-17 levando a uma proteção aos danos cardíacos. Houve também controle na liberação das quimiocinas CCL2 e CCL5, além de reduzir o parasitismo sanguíneo e tecidual, se mostrando, em modelo experimental, um possível bom tratamento de apoio na terapêutica da doença de Chagas.
Vale ressaltar que, embora neste trabalho tenhamos usado o Benzonidazol apenas como controle de tratamento, o mesmo foi capaz de igualar todos os parâmetros avaliados ao grupo de animais não infectados. Sabemos que esse fármaco, mesmo sendo ministrado em fase aguda, possui pífia eficácia contra a cepa “Colombiana” do T. cruzi, mas se mostrou hábil em promover redução do parasitismo sanguíneo e tecidual, além de manter basais os níveis de marcadores inflamatórios circulantes e a taxa de migração celular tecidual.
Quanto ao tratamento em combinação entre o Enalapril e Losartan, observou-se um padrão peculiar onde não houve interferência dessa estratégia no parasitismo sanguíneo e tecidual (contrário às monoterapias). Entretanto, notou-se uma redução em alguns marcadores inflamatórios circulantes e redução na inflamação observada no tecido muscular cardíaco. Assim, observou-se que para aspectos inerentes ao parasito, esse tratamento de combinação não foi eficiente, mas o foi quanto aos aspectos referentes ao hospedeiro. A partir dessas observações propomos uma hipótese onde o parasito deve possuir receptores para interação com o Enalapril e o Losartan, no entanto essa combinação seria antagônica ao que se refere ao parasito. Porém, para os receptores celulares do hospedeiro vertebrado essa associação não apresentaria antagonismo.
Outro ponto interessante é o fato de o tratamento com o Losartan apresentar maior redução no perfil inflamatório circulante em relação ao tratamento com o Enalapril. A interferência do tratamento com inibidores da ECA, na via de degradação da bradicinina, poderia explicar esse dado. A bradicinina, importante marcador inflamatório possui uma via de degradação atrelada à enzima conversora da angiotensina (Nishio et. al., 2011), sendo sua atividade inibida pelo tratamento com o Enalapril conseqüentemente resultando em maior teor de bradicinina no organismo. O Enalapril seria capaz de reduzir a inflamação durante a fase aguda da infecção
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experimental pelo T. cruzi pela redução direta dos níveis circulantes de aldosterona e pela sua possível ação na inibição da replicação do parasito, sendo que a presença da bradicinina atuaria a favor do aumento da resposta inflamatória. Já no tratamento com o Losartan, a liberação da aldosterona é inibida devido ao próprio Losartan e o composto EXP-3174 serem antagonistas do receptor da Angio II (Santagada et. al., 2003), não havendo interferências nas ações da ECA, permitindo assim a degradação da bradicinina e, por conseguinte, que esse tratamento leve a uma maior supressão na inflamação circulante.
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