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O diagnóstico da doença deve ser feito tão cedo possível, a fim de prevenir a progressão para o estadio tardio ou encefalítico, e evitar determinadas terapias complicadas e arriscadas que expõem o doente a um risco acrescido (WHO, 2017). É feito através de métodos laboratoriais, porque as caraterísticas clínicas da infeção não são suficientemente específicas. O diagnóstico definitivo é dado pela presença do parasita no líquido biológico (sangue, linfa) ou tecido por microscopia. As duas formas de tripanossomíase geralmente seguem o mesmo procedimento de diagnóstico (Figura 14): (I) triagem pelo método imunológico ou sorológico, (II) confirmação por microscopia ou método parasitológico e (III) caracterização do estadio por punção lombar. (Burri, Chappuis, & Brun, 2014) (Malvy & Chappuis, 2011) Casos suspeitos diagnosticados por método serológico são submetidos ao diagnóstico confirmatório pela pesquisa do parasita no sangue e/ou linfa e, em caso de resultado positivo, segue para a determinação do estadio pela avaliação do líquido cefalorraquidiano (LCR) (Burri, Chappuis, & Brun, 2014)

O diagnóstico de T. b. rhodesiense difere de T. b. gambiense em alguns aspetos:

• O rastreio baseia-se no reconhecimento do quadro clínico não específico (febre) e história de exposição ao vetor, pois não existe um teste sorológico específico para T.

b. rhodesiense. (CDC, 2016; Malvy & Chappuis, 2011)

• Devido à alta densidade de parasitas circulantes no sangue, principalmente na primeira fase da doença, a confirmação parasitológica é mais fácil para T. b.

rhodesiense do que para T. b. gambiense (CDC, 2016; CDC, 2012; Malvy & Chappuis,

• Parâmetros biológicos, como testes de coagulação, doseamento de hemoglobina e contagem de plaquetas destes doentes estão quase sempre alterados. (Malvy & Chappuis, 2011)

3.6.1. Método imunológico

Este método é baseado no uso do CATT. Trata-se de um teste rápido de triagem sorológica usado na grande maioria dos países endémicos nos programas de controlo da doença, rastreios de massa ou pesquisas ativas (grande número populacional (CDC, 2016; Burri, Chappuis, & Brun, 2014; Malvy & Chappuis, 2011) A sensibilidade do CATT no sangue total não diluído é elevada (87-98%), o que pressupõe um elevado valor preditivo negativo de um teste negativo, (Burri, Chappuis, & Brun, 2014; Malvy & Chappuis, 2011) O CATT é um teste barato, de fácil execução no terreno e rápido pois em aproximadamente 5 minutos se obtém os resultados. A base deste teste é um reagente composto por Trypanossoma liofilizados corados de antigénios variáveis selecionados (VATs). Não existe algum teste sorológico específico no momento para o rastreio da T.b. rhodesiense, para tal a deteção de parasitas no sangue é muito mais fácil nesta forma da doença. (Burri, Chappuis, & Brun, 2014) Se a decisão de tratamento for tomada em função a diluição do CATT (‡ 1: 16) com altos títulos, a situação epidemiológica deve ser considerada pois só é aceitável em áreas de alta prevalência da doença (maior de 1%), principalmente quando as técnicas mais sensíveis de concentração sanguínea se encontram indisponíveis. (Burri, Chappuis, & Brun, 2014; Malvy & Chappuis, 2011)

3.6.2. Método parasitológico

O diagnóstico sorológico ou imunológico da infeção por Trypanossoma spp por si não justifica a indicação para o tratamento da doença, devido à toxicidade relativa das drogas em usadas. Assim, a deteção do parasita é de grande importância pois acaba tendo um papel confirmatório do diagnóstico. (Burri, Chappuis, & Brun, 2014) Os liquidos biológicos geralmente mais usados para o exame parasitológico ou microscópico são: sangue, aspirado de nódulos linfáticos e LCR, bem como também podem ser observados nos aspirados de medula óssea e no liquido ascítico (Burri, Chappuis, & Brun, 2014) (Malvy & Chappuis, 2011). • Métodos de deteção de Trypanossonoma no sangue:

✓ Esfregaço sanguíneo (fino, grosso ou húmido)

É útil para deteção direta de Trypanossoma spp. Os esfregaços sanguíneos húmidos são usados para a deteção do parasita móvel, enquanto os esfregaços de sangue fino e espesso são fixados em metanol e corados com o corante Giemsa. (Burri, Chappuis, & Brun, 2014) O atraso entre a recolha da amostra e a posterior análise por microscopia deve ser minimizado,

porque o Trypanossoma perde a mobilidade em poucas horas. Por serem móveis é mais fácil detetar o parasita pelo exame microscópico em preparações húmidas frescas (CDC, 2016).

✓ Métodos de concentração

Como os parasitas circulantes são poucos, é necessário usar técnicas de concentração sanguínea. (Malvy & Chappuis, 2011) Estas aumentam a possibilidade de deteção do parasita, porque a parasitémia, em infeções por T. b. gambiense, geralmente é muito baixa (Burri, Chappuis, & Brun, 2014).

✓ Técnica de centrifugação microhematócrito (m-HCT) ou técnica de centrifugação ou tubo capilar.

Baseia-se no exame microscópico da zona da camada leucoplaquetária das células sanguíneas usando a objetiva de baixa potência (10x ou 20x) após centrifugação em capilares de microhematócrito. (Burri, Chappuis, & Brun, 2014) No sangue centrifugado, o parasita sedimenta logo acima das células brancas, e o exame da camada leucoplaquetária aumentará a sensibilidade. (CDC, 2016) Esta técnica de centrifugação microhaematócrito, permanece amplamente utilizada no terreno. (Burri, Chappuis, & Brun, 2014; Malvy & Chappuis, 2011) A camada leucocitária quantitativa é mais sensível, permite uma discriminação mais fácil entre Trypanossoma e os leucócitos e, concomitantemente, deteta os parasitas da malária. A sensibilidade da m-HCT aumenta com o número de tubos capilares examinados (seis a oito tubos devem ser utilizados), mas não excede 60% (Malvy & Chappuis, 2011).

✓ Técnica de centrifugação por troca aniónica (m-AECT)

Baseada na deteção de Trypanossoma no eluido após a passagem do sangue infetado através de uma coluna de troca aniónica (dietilaminoetilcelulose) seguida de centrifugação, (Burri, Chappuis, & Brun, 2014). Consiste em separar o parasita do sangue venoso e concentrá-lo em um tubo por centrifugação. (Malvy & Chappuis, 2011) É atualmente o método mais sensível para a deteção de Trypanossoma em condições de terreno (Burri, Chappuis, & Brun, 2014; Malvy & Chappuis, 2011).

• Análise da linfa:

É examinada uma preparação húmida do aspirado de nódulo linfático com uma ampliação de 400x. FIND Diagnostics e Carl Zeiss desenvolveram um novo método simples usando a microscopia de fluorescência após coloração com acridina laranja. A sensibilidade e a facilidade de desempenho são superiores à microscopia de campo claro (Burri, Chappuis, & Brun, 2014)

Figura 14- Diagrama para o diagnóstico da Tripanossomiase africana. Adaptado de (Malvy & Chappuis, 2011).

3.6.3. Classificação do estadio

É obrigatório a punção lombar em todos os doentes confirmados com a patologia, para o estadio da doença (saber se há comprometimento do SNC). (CDC, 2016; Malvy & Chappuis, 2011; M, et al., 2005) Isto porque o tratamento entre o primeiro e o segundo estadio difere. O estadio tardio ou meningo-encefalítico é definida pela presença de Trypanossoma e valor de glóbulos brancos superior a 5/mm3 no LCR. (Malvy & Chappuis, 2011) Os parâmetros estabelecidos pela OMS incluem ainda o aumento de proteínas no LCR. (CDC, 2012) Um outro marcador fiável que sugere envolvimento neurológico é o aumento da concentração de IgM anti-Trypanossoma no LCR. (CDC, 2016; Malvy & Chappuis, 2011)