5. RESULTATER
5.4 M UNTLIG GJENFORTELLING
Os fungos são microrganismos que constituem um grupo diversificado e abundante na natureza. São caracterizados por estruturas unicelulares ou multicelulares e classificados de acordo com sua morfologia em filamentosos, leveduras e dimórficos. São seres eucarióticos, isto é, apresentam uma membrana nuclear que envolve os cromossomos e o nucléolo. São classificados como seres heterotróficos por não possuírem pigmentos fotossintéticos (SIDRIM; ROCHA, 2004).
Dentre estes fungos destaca-se a Candida albicans, que é caracterizada como uma levedura oportunista que invade áreas do corpo humano, provocando infecções cutâneas e mucocutâneas (EZZAT, 2001). Na cavidade bucal esta infecção, denominada de candidose oral, geralmente acomete pacientes imuncomprometidos ou aqueles usuários de prótese dentária, que não realizam higienização.
O diagnóstico de candidose oral apresenta-se como um preditor para infecções pelo vírus do HIV, sendo considerado um marcador biológico desta doença, em alguns casos. Desta forma, o isolamento de C. albicans de pacientes portadores do vírus do HIV tem sido frequente (CORRÊA; ANDRADE, 2006; GABLER et al., 2008; POZZATTI et al., 2008). Estudos acerca da virulência das espécies de Candida são necessários, já que estão inseridas na etiologia da candidose oral, pois Samaranayake (1992) afirmou que 81 espécies do gênero Candida são identificadas, sendo a C. albicans a mais prevalente.
O isolamento de Candida spp. da cavidade bucal não implica, necessariamente, na ocorrência de infecções, sendo tal fato observado em indivíduos saudáveis (SAMARANAYAKE; SAMARANAYAKE, 2001). A invasão tecidual por C. albicans ocorre por meio da ativação da via de transdução de sinal MAP (mitogen-activated protein) Kinase, ocorrendo interferências na formação da parede celular, adaptação ao estresse osmótico e reprodução do fungo (MONGE et al., 2006). Outras características conferem à levedura um caráterpatogênico, como a formação de pseudohifas, concedendo às leveduras um caráter de virulência, o qual é expresso pela C. albicans, sendo estas
estruturas que dificultam a fagocitose e assim permitem o estabelecimento da espécie no tecido invadido (ROMANI; BISTONI; PUCETTI, 2003).
O tratamento medicamentoso da candidose oral inclui a utilização de antifúngicos sintéticos sistêmicos dentre eles a Anfotericina B, outras alternativas são os triazólicos (fluconazol, itraconazol e voriconazol). Como tratamento tópico prescreve-se o uso do miconazol ou nistatina (PFALLER et al., 2004). O tratamento medicamentoso da candidose oral, principalmente para pacientes infectados pelo HIV, é feito por tempo prolongado, tal fato em conjunto com a pouca disponibilidade de novas drogas aliado à pouca disponibilidade de novos produtos desenvolvidos pela indústria farmacêutica tem gerado a busca por conhecimento sobre a susceptibilidade dos fungos a novas substâncias (WINGETER et al., 2007).
Além disto, o uso indiscriminado de agentes antifúngicos gera o aparecimento de espécies resistentes à terapia convencional (BANSOD; RAI, 2008). Assim, tem-se estimulado a busca por novos fármacos que atuem de forma eficiente, gerando os mesmos efeitos farmacológicos, entretanto sem a adição da resistência microbiana ou efeitos tóxicos.
Outro fato a ser destacado é a necessidade de confirmação laboratorial das espécies inseridas nos casos de candidose oral, entretanto tal manobra não é realizada por muitos profissionais, desta forma não se conhece a susceptibilidade das leveduras aos agentes antifúngicos, gerando assim espécies resistentes. Desta forma, o presente estudo teve o objetivo de avaliar a atividade antifúngica de óleos essenciais, extraídos de espécies vegetais bem como determinar o comportamento de amostras de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos frente aos produtos avaliados.
Na odontologia, os produtos naturais tem sido usados como agentes antiinflamatórios, antibióticos, analgésicos, sedativos e em tratamentos como o endodôntico, atuando como soluções irrigadoras (GROPPO et al., 2008). Muitas espécies vegetais apresentam potencial para novas terapias odontológicas, entretanto a maioria dos estudos são iniciais, in vitro, notando- se a necessidade de estudos in vivo que demonstrem o baixo potencial tóxico e efeito farmacológicos destes produtos (GROPPO et al., 2008).
Os óleos essenciais são misturas complexas, extraídos de espécies vegetais, sendo sintetizados e armazenados em algumas estruturas das plantas como os idioblastos ou tricomas glandulares. As condições ambientais podem alterar a concentração dos princípios nos óleos essenciais (GONÇALVES et al., 2003). Os constituintes químicos desses óleos aromáticos variam desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples, fenóis, aldeídos, éteres, ácidos orgânicos, ésteres, cetonas, lactonas, cumarinas, até compostos contendo nitrogênio e enxofre (SIMÕES et al., 2004; GAYOSO et al., 2005 ).
Estudos avaliaram a atividade antifúngica de óleos essenciais frente a C.
albicans, utilizando como técnica a difusão em ágar, assim determinaram a presença ou ausência da atividade antifúngica de alguns óleos essenciais (BARBARO, STELATO, 2009; PAWAR, THAKER, 2006; CAVALCANTI; ALMEIDA; PADILHA, 2011). É válido destacar que esta metodologia serve como uma triagem (screening) da ação do produto, assim não determina em qual concentração obtêm-se uma melhor atividade antimicrobiana, já que na maioria dos estudos, realiza-se tal teste com o produto natural em sua formulação pura.
O objetivo inicial do presente estudo foi avaliar a atividade antifúngica dos óleos essenciais de Ocimum basilicum (manjericão), Cymbopogon martinii (palmarosa), Cyperus articulatus (piprioca), Thymus vulgaris (tomilho branco) e
Cinnamomum cassia (canela da china) frente cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos e cepa padrão (ATCC 76485). Utilizou-se a técnica da difusão em ágar, sendo a atividade antifúngica avaliada por meio da medição dos halos de inibição dos óleos frente às cepas. Do estudo conclui-se que O.
basilicum, C. martinii, T. vulgaris e C. cassia apresentaram ação antifúngica frente às cepas testadas, corroborando com estudos realizados por Barbaro; Stelato (2009), Duarte et al. (2005) e Giordani et al.(2006).
Assim, observou-se que quatro dos cinco óleos essenciais triados apresentaram atividade antifúngica, entretanto este resultado não foi conclusivo, pois a metodologia utilizada requer o emprego do meio de cultura sólido, o qual pode impedir a difusão do óleo essencial que é hidrófobo, sendo caracterizado como um teste de baixa sensibilidade (ALLEN; MOLAN; REID, 1991), entretanto de fácil execução e baixo custo.
Assim, após a triagem da atividade antifúngica determinou-se a
Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos óleos essenciais de O. basilicum, C.
martinii, T. vulgaris e C. cassia frente às cepas clínicas e padrão de C.
albicans. Para tal ensaio foram testadas concentrações que variaram entre 1024 µg/mL e 4µg/mL, de acordo com proposto por Ellof (1998). Empregou-se a metodologia da microdiluição em caldo, sendo a CIM designada a menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico, no meio de cultura líquido (CASTRO; LIMA, 2010).
Os resultados do teste de microdiluição demonstraram que os óleos essenciais de T. vulgaris e O. basilicum não apresentaram atividade inibitória nas concentrações avaliadas. Alguns estudos apresentaram atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de T. vulgaris e O. basilicum (SARTORATO et al., 2004; DUARTE et al., 2005), entretanto deve-se destacar que a composição dos óleos essenciais podem variar de um ambiente para outro de acordo com a disponibilidade de água no solo e condições climáticas (FREIRE et al., 2006).
Já os óleos essenciais de C. martinii e C. cassia apresentaram valores de CIM variando entre 1024 e 256µg/mL e 128 e 64µg/mL, respectivamente. Estes dados confirmam alguns estudos encontrados na literatura (PRASHAR et al., 2003; DUARTE et al., 2005; GIORDANI et al., 2006). Assim, constatou-se que a composição do óleo essencial pode interferir em sua atividade antifúngica, bem como a forma de coleta do material vegetal e critérios climáticos.
Dentre os óleos essenciais avaliados o de C. cassia foi o mais efetivo frente às cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos e padrão (ATCC 76485). Assim, este óleo foi selecionado para a realização dos testes de cinética sobre a curva de morte das leveduras e alterações sobre a micromorfologia fúngica.
Devido à escassez de estudos que tratem sobre o comportamento de produtos com ação antifúngica sobre a curva de morte microbiana, avaliamos que o presente estudo apresenta-se pioneiro, já que a atividade antifúngica do óleo essencial de C. cassia, até então, havia sido avaliada apenas por meio da determinação da CIM, sem ser verificado o impacto do tempo de ação e
concentração do produto frente às leveduras. Diante disto, constatou-se que na CIM, o óleo essencial de C. cassia foi capaz de diminuir o crescimento das leveduras, sendo este efeito diretamente proporcional à concentração do óleo essencial.
No presente estudo foi investigada a atividade antifúngica do óleo essencial de C. cassia e as alterações na micromorfologia das cepas de C.
albicans, observando-se que a presença de clamidoconídeos e pseudohifas foi alterada pelo uso do óleo essencial já na CIM. Estas estruturas conferem virulência às cepas sendo relatado por Sidrim; Rocha (2004) que os fungos leveduriformes, tendo em sua reprodução assexuada a formação de blastoconídeos, clamidoconídeos e pseudo-hifas
Diante do exposto verifica-se que os óleos essências de C. martinii e C.
cassia obtiveram atividade antifúngica desejável tendo o segundo um efeito superior. Assim verifica-se que novos estudos, in vitro ou ensaios clínicos, incorporando a utilização de metodologias que busquem o isolamento dos fitoconstituintes, atividade antifúngica sobre espécies não albicans sejam realizados a fim de obter-se maiores conhecimentos acerca do uso do óleo essencial de C. cassia como eficiente agente antifúngico.
4. Conclusões
Os óleos essenciais de Cyperus articulatus (piprioca), Thymus vulgaris (tomilho) e Ocimum basilicum (manjericão) não apresentaram atividade inibitória sobre o crescimento das cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos;
Os óleos essenciais de Cymbopogon martinii (palmarosa) e
Cinnamomum cassia (canela) apresentaram CIM dentro das concentrações analisadas;
O óleo essencial de C. cassia apresentou atividade antifúngica sobre a curva de morte microbiana das amostras clínica e padrão de C. albicans; O óleo essencial de C. cassia promoveu alterações na micromorfologia
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