A Calorimetria Diferencial de Varredura é uma técnica calorimétrica muito utilizada no estudo da energética conformacional de biopolímeros quando estes são submetidos a uma variação controlada de temperatura. Com isso, é possível se determinar dados termodinâmicos absolutos para transições termicamente induzidas. Esta técnica é frequentemente utilizada no estudo de estabilidade e enovelamento protéicos, caracterização de membranas, lipídios, ácidos nucléicos e sistemas micelares, na avaliação dos efeitos de mudanças estruturais na estabilidade de moléculas, entre outros.
A técnica de DSC também tem sido aplicada em estudos de transições de fase lipídicas tanto em modelos de membranas quanto em membranas biológicas e em suas interações com
pequenas moléculas (hormônios, peptídeos, drogas, fármacos). O conhecimento dos efeitos causados por estas pequenas moléculas quando da sua interação com membranas pode ser de fundamental importância na elucidação dos seus mecanismos de ação. Estas moléculas podem tanto apresentar os próprios lipídios como alvo específico quanto induzir mudanças estruturais e dinâmicas na estrutura da membrana, que pode disparar sinais para mudanças conformacionais em proteínas, possibilitando o acionamento de algum outro mecanismo ou evento biológico importante.
Nos experimentos de DSC, uma amostra e uma referência são aquecidas ou resfriadas a uma taxa constante pré-determinada (dT/dt). Diferenças de temperatura entre as celas de referência e da amostra são medidas e calibradas em unidades de potência (quantidade de calor por unidade de tempo - dQ/dt). Esta potência é, na realidade, uma diferença no fluxo de calor da cela da amostra relativa à cela de referência. Neste caso particular, suspensões lipídicas puras ou com os fármacos antimaláricos foram usadas na cela da amostra e um tampão específico na cela de referência.
Quando a amostra se encontra longe do evento térmico, as temperaturas de ambas as celas mudam linearmente com o tempo à mesma taxa dT/dt, e a diferença de temperatura entre elas permanece zero. Isto se reflete, idealmente, numa linha de base reta e horizontal. Em contrapartida, quando a amostra sofre uma transição de fase termotrópica, há uma diferença detectável de temperatura entre as celas da amostra e de referência e o calorímetro modifica ativamente a entrada de fluxo de calor para a cela da amostra para anular este diferencial de temperatura. Esta diferença de fluxo de calor para ambas as celas se reflete numa deflexão positiva ou negativa da linha de base original, dependendo se o evento é endotérmico ou exotérmico. Concluída a transição de fase, a condição de linha de base original é restabelecida ou uma nova linha de base se estabelece se houver mudança na capacidade térmica da amostra (48).
Esta mudança é mais frequente em estudos de desenovelamento protéico, onde os calores específicos dos estados nativo e desnaturado são diferentes, provavelmente devido a mudanças na hidratação das cadeias laterais que estão “escondidas” no estado nativo, mas tornam-se expostas ao solvente no estado desnaturado.
Como resposta termodinâmica do sistema à taxa de fornecimento de calor, um gráfico da diferença do fluxo de calor (dQ/dt) entre ambas as celas como função da temperatura é gerado na saída do instrumento e a intensidade do sinal é diretamente proporcional à taxa de aquecimento ou resfriamento (dT/dt) da amostra.
Os experimentos de DSC são realizados à pressão constante. É bem conhecido da termodinâmica que, em um processo isobárico, a quantidade de calor fornecida a um sistema é igual à variação de entalpia do mesmo e, usando a própria definição de capacidade calorífica:
dT
dH
dt
dT
dt
dQ
dT
dQ
C
p p=
=
=
A expressão acima mostra que o termograma gerado pelo calorímetro fornece a dependência com a temperatura da capacidade calorífica isobárica da amostra.
Em um experimento de transição de fase em um biopolímero simples (hipotético termograma apresentado na Figura 2), o DSC pode diretamente medir ou permitir o cálculo de alguns parâmetros termodinâmicos importantes que caracterizam uma molécula biológica. Por exemplo, a entalpia calorimétrica total de algum evento termicamente induzido na amostra pode ser determinada através da área sob a curva obtida:
=
Figura 2. Endoterma caracterizando um evento térmico em um biopolímero hipotético. A entalpia
calorimétrica é a área sob a curva que mostra a dependência com a temperatura da capacidade calorífica da amostra à pressão constante. O Cp do processo é definido na temperatura de melting (TM) ou temperatura de transição de fase, onde a capacidade calorífica apresenta um máximo.
A temperatura de transição de fase, usualmente denotada por TM, é aquela na qual a
capacidade calorífica atinge um máximo e, em casos como o desenovelamento protéico, é um indicativo da estabilidade do sistema. Em transições de fase de primeira ordem, tal como a transição da fase gel para a líquido-cristalina em fosfatidilcolinas (73), a variação da energia livre de Gibbs ( G) na temperatura de transição é nula, portanto a mudança na entropia associada com a transição pode ser calculada diretamente da equação:
M cal
T
H
S
=
∆
∆
A mudança na capacidade calorífica à pressão constante ( Cp na Figura 2) do evento
importante está relacionado com o grau de cooperatividade do processo experimentado pelas moléculas na amostra. Quanto menor a largura em temperatura à meia altura na curva de transição, ∆T1/2, maior será a cooperatividade naquele processo termotrópico. Os valores de
2 / 1
T
∆ podem variar desde cerca de 0,1ºC, para fosfolipídios sintéticos muito puros, até 10 a 15ºC para membranas biológicas. Dos valores de TM e ∆T1/2determinados para uma transição de fase
em um fosfolipídio, a entalpia de van’t Hoff,
∆H
VH, pode ser aproximadamente determinada através da relação 2 / 1 29
.
6
T
T
H
M VH∆
≅
∆
A razão entre as entalpias calorimétrica e de vant’ Hoff fornece o valor da unidade cooperativa, n: 2 / 1
1
T
H
H
n
cal VH∆
∆
∆
=
α
Este parâmetro é uma medida indireta do grau de cooperação intermolecular entre os fosfolipídios em uma vesícula, por exemplo. É bem sabido que, em uma transição de fase lipídica, os fosfolipídios não transicionam independentemente uns dos outros, e sim, em forma de aglomerados lipídicos (74-76). O valor de n representa, por conseguinte, o número médio de moléculas de lipídios nestes aglomerados que participam da transição de fase como uma unidade cooperativa. Em um processo de primeira ordem completamente cooperativo de uma substância pura, n deve tender ao infinito e para um processo completamente não-cooperativo, este parâmetro deve tender à unidade. Note que n é inversamente proporcional a ∆T1/2. Isto reforça o fato de que quanto mais isotérmica é uma transição, mais cooperativo é o sistema.
Resumindo, a técnica de DSC é uma ferramenta analítica de fácil manuseio, comparativamente mais simples e muito útil no estudo termodinâmico de transições de fase de lipídios, permitindo o entendimento de mudanças entálpica e entrópica que ocorrem quando um biopolímero passa por um evento termicamente induzido e os efeitos causados por agentes externos quando interagem com ele.