4. Diskusjon
4.1. Ungdommenes vei mot selvstendighet
thuringiensis por qPCR tempo real
RESUMO - A técnica de PCR tempo real é uma opção bastante atraente dentro do contexto do controle biológico de pragas, pois possibilita o monitoramento da quantificação da expressão de genes cry de B. thuringiensis e a associação desta expressão à mortalidade de larvas de pragas agrícolas. Sendo assim, a expressão dos genes cry1Ab e cry1Ac por qPCR (PCR quantitativo) tempo real foi realizada para 15 isolados e três linhagens padrão de B. thuringiensis com o intuito de associar a taxa de expressão destes genes à mortalidade de larvas de duas populações de S. frugiperda. Para tanto o RNA total dos isolados e das linhagens padrão foi extraído em dois diferentes tempos de cultivo e, em seguida, transformado em cDNA. As amostras de cDNA foram submetidas a amplificação com o fluoróforo TaqMan® por qPCR tempo real para os genes cry1Ab, cry1Ac e fabI, usado com controle endógeno; os valores Ct obtidos foram analisados no programa RQ Study pela equação 2-ΔΔCt. A expressão do gene cry1Ab, não foi constatada em nenhum dos isolados nas condições analisadas e, para o gene cry1Ac, todos os isolados apresentaram taxa de expressão em pelo menos um dos horários de isolamento. Os resultados de expressão foram associados ao potencial de controle das larvas de S. frugiperda das populações testadas, sendo que os elevados níveis de expressão do gene cry1Ac foram associados diretamente a elevado potencial de controle da população de laboratório.
INTRODUÇÃO
Os organismos respondem a diferentes estímulos ambientais por meio de alterações no proteoma, conjunto de proteínas das células. Esse processo permite adaptações a condições adversas, como choque térmico, exposição a drogas, ataque de patógenos, entre outros. O fluxo da informação gênica do DNA nos cromossomos (genoma) até o proteoma é intermediado pelo conjunto das moléculas de RNA (transcriptoma). Assim, a concentração relativa dos transcritos de um determinado gene em uma célula é um indicativo do quanto esse gene está sendo expresso, ou seja, do quanto a célula está investindo do seu maquinário bioquímico para produzir a proteína codificada pelo gene (FELIX et al., 2003).
Os métodos tradicionais utilizados na análise diferencial da expressão gênica incluem, entre outros, “northern blotting” (ALWINE et al., 1997), “diferencial display” (LIANG & PARDEE, 1992), RNA “fingerprinting” por PCR (WELSH et al., 1992), RDA (“representational difference analysis”) (LISISTYN et al., 1993), SAGE (“serial analysis of gene expression”) (VELCULESCU et al., 1995) e “macroarray” (FELIX et al., 2003).
Cada uma destas técnicas apresenta vantagens únicas, tais como simplicidade e baixo custo e também algumas limitações, como a análise unidirecional e baixa especificidade. No entanto todas têm sido citadas como ferramentas indispensáveis na análise da expressão gênica (KOZIAN & KIRSCHBAUM, 1999).
As mais recentes pesquisas de quantificação gênica estar sendo realizadas pela técnica de PCR tempo real. Esta pode ser aplicada para quantificar absolutamente cópias de DNA de qualquer amostra em que se queira detectar e identificar organismos geneticamente modificados, presença de transgênicos em grãos alimentos, detecção de patógenos, kits de diagnóstico, entre outras aplicações. Paralelamente, a quantificação relativa permite a comparar taxas de expressão gênica em diferentes condições e/ou grupos celulares, tanto para procariotos como eucariotos. Os avanços da técnica de PCR tempo real fornecem aos laboratórios de pesquisa uma nova ferramenta de rotina, com uma eficiência nunca antes atingida em termos de rapidez e desempenho.
Sendo assim essa técnica é uma opção bastante atraente dentro do contexto do controle biológico de pragas, pois possibilita o monitoramento da quantificação da
expressão de genes cry de B. thuringiensis e a associação desta expressão à mortalidade de larvas de pragas agrícolas. Diante disso, a expressão dos genes cry1Ab e cry1Ac por qPCR (PCR quantitativo) tempo real foi realizada para 15 isolados de B. thuringiensis e três linhagens padrão com o intuito de associar a taxa de expressão destes genes à mortalidade de larvas de duas populações de S. frugiperda.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Linhagens Bacterianas
Foram analisados 15 isolados de B. thuringiensis obtidos de amostras de solos de diferentes locais do Estado de São Paulo pertencentes ao Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA), junto ao Departamento de Biologia Aplicada a Agropecuária na Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Câmpus de Jaboticabal-SP. Além destes, foram utilizadas quatro linhagens padrão: B. thuringiensis var. kurstaki HD1, var. tolworthi, var. kurstaki HD73 e var. tenebriones (Tabela 1).
Tabela 1. Isolados de B. thuringiensis utilizados no trabalho, local de isolamento e resultado da caracterização por PCR qualitativo.
Isolados Local de isolamento cry1 Ab cry1Ac R25 Itapeva + + R26 Campinas - + R74 Capão Bonito + + R123 Itapeva - + R125 Itapeva - + R144 Piracicaba - + R148 Piracicaba - + R155 Piracicaba - + R156 Piracicaba - + R158 São Paulo - + R230 Campinas - + R240 Campinas - + R248 Campinas - + R273 Campinas - + R277 Campinas - + var. kurstaki - HD1 BGSC + + var. kurstaki – HD73 BGSC - + var. tolworthi BGSC + - var. tenebriones BGSC - -
(+) presença de banda em gel de agarose 1,5% e (-) ausência de banda. BGSC – Bacillus Genetics Stock Center.
2. Determinação do controle endógeno
Para a detecção do gene fabI um par de oligonucleotídeo iniciador foi elaborado pelo software GenRunner (Tabela 2).
Tabela 2. Sequências dos iniciadores para a detecção do gene fabI.
Iniciador Sequência Produto esperado (pb)
fabI (forward) GCGGATACATTAGAAGGACAAG
250
fabI (reverse) CTTTCTTCGCTTCTCTTGCTAC
As reações de amplificação para o gene fabI, foram conduzidas em um volume de 20 Pl contendo: 60 ng de DNA molde, 250 PM de uma solução de dNTPs (10mM); 2,0 mM de MgCl2 ; 0,3 PM de cada iniciador; 1,0 U da enzima Taq DNA polimerase
(Invitrogen®); solução tampão para a reação de PCR (1X) e água destilada Milli-Q previamente esterilizada (qsp 20 Pl).
As reações de amplificação foram realizadas em aparelho termociclador (PTC- 100 “Programmable Thermal Controller” - MJ Research, inc.), equipado com circuito “Hot Bonnet”, onde foi utilizado o seguinte programa: um passo inicial de desnaturação de 5 min a 95qC e 31 ciclos consistindo de um ciclo de desnaturação a 95oC por 1 min; pareamento dos oligonucleotídeos iniciadores a 500C por 1 min e extensão a 72oC por 1 min e, ao final dos ciclos, um passo extra de extensão a 72qC por 5 min. Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose a 1,5%, conforme SAMBROOK & RUSSEL (2001).
3. Elaboração das sondas
Dentre as opções existentes para realização de experimentos com o sistema TaqMan® foi selecionado o kit Custom TaqManGene Expression Assays. As sondas foram elaboradas pelo software File Builder 3.1 (Applied Biosystems) de acordo com as regiões pré estabelecidas no capitulo 2. Para o gene cry1Ab a sequência da sonda foi
CAACCTTAAGAGTAAATATTACTGCAC e para o gene cry1Ac igual à
GTTCCAATTCACTTCCCATCGACA.
4. Cultivo dos isolados bacterianos para extração do RNA total
As fases de desenvolvimento da bactéria B. thuringiensis foram determinadas de acordo com GUIDELLI-THULER et al (2008). Sucessivas análises microscópicas das culturas bacterianas foram realizadas para a confirmação do comportamento dos isolados e validação das fases de desenvolvimento determinadas pelos autores.
Após a definição do tempo de isolamento do RNA, células dos diferentes isolados e das linhagens padrão de B. thuringiensis foram cultivadas em meio semi- sólido Nutriente Agar e incubadas a 30oC por 18 h. Colônias isoladas foram inoculadas em 50 ml de meio Caldo Nutriente e cultivadas sob agitação de 200 rpm a 30oC, por 12
h (DO 1,8) e 1 ml do pré-inoculo de cada isolado foi inoculado duas vezes em 50 ml de Caldo Nutriente. As células foram cultivadas por 6 horas e 30 min e por 8 horas, em seguida foram imediatamente submetidas à extração do RNA total.
5. Extração do RNA total
O isolamento do RNA total dos 15 isolados como também das linhagens padrão B. thuringiensis var. kurstaki - HD1, B. thuringiensis var. tolworthi e B. thuringiensis var. tenebrionis foi obtido pelo Kit RNAspim (Amersham Biosciences®), seguindo as instruções do fabricante.
Para tanto 1 ml das culturas bacterianas foram centrifugadas a 15294 Xg por 2 min à 4oC. O precipitado bacteriano foi ressuspendido em 100µl de TE (10mM TrisHCl, 1mM EDTA - pH 7.4) com 20 mg.ml-1 de lisozima e incubados a 37oC por 1 hora. Após esse período foram adicionados às amostras 350μl de tampão RA1 e 3,5μl de β- mercaptoetanol, seguida de agitação vigorosa em aparelho do tipo ‘vortex’. Essa mistura foi aplicada em mini-filtro presente no kit e centrifugada a 15294 Xg por 1 min; 350µl de etanol 70% foram adicionados e misturados duas vezes em aprelho do tipo ‘vortex’ por 5 segundos cada.
O volume total das amostras foi aplicado à coluna de sílica e centrifugado a 8.000 Xg por 30 s, em seguida 350µl de MDB foram adicionados à membrana e centrifugados por mais 1 min a 11.000 Xg, para secar a membrana, o liquido foi descartado e a membrana foi transferida para um tubo novo estéril. Uma solução composta por 10µl de DNaseI e 90µl de tampão de reação da DNaseI foi preparada e 95µl desta foi aplicado no centro da coluna de sílica e incubado a temperatura ambiente por 15 min.
Em seguida foram realizadas três lavagens. Na primeira foi adicionado à coluna 200µl de RA2, seguida de centrifugação por 1 min a 11.000 Xg. Durante a segunda
lavagem 600µl de RA3 em temperatura ambiente foi aplicado e centrifugado por mais 1
min a 11.000 Xg, na última lavagem, 250µl de RA3 foram adicionados à coluna e
submetidos à centrifugação por 2 min a 11.000 Xg. A coluna de sílica foi transferida para um tubo estéril, livre de DNA e 100µl de água DEPC (livre de RNase) foi aplicado
e centrifugado por 1 min a 11.000 Xg. A partir desse momento o RNA estava pronto para estocagem em temperatura igual a - 80oC.
A integridade do RNA foi analisado em gel de agarose (1,2%) contendo brometo de etídeo (0,5 g.ml-1) e submetido à eletroforese horizontal por 2 h, a 80 V, conduzida em tampão TAE 1X (Tris 89 mM, EDTA 2,5 mM e Acido Bórico 89 mM com pH 8,3), preparado com água DEPC. O gel de agarose foi visualizado sob luz UV e fotodocumentado em equipamento fotodocumentador (GEL DOC 2000 – Bio-Rad®), através do software Quantity-one.
As amostras foram quantificadas em espectrofotômetro (BECKMAN®, modelo DU-640B), nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm, sendo a relação 260/280 calculada. Para estimar a quantidade de produto obtida foi utilizado o padrão em que uma unidade de densidade óptica (DO) equivale a 40 Pg de RNA por ml de solução (SAMBROOK & RUSSEL, 2001).
6. Reações de RT-PCR
Após a obtenção das amostras de RNA total a técnica de RT-PCR (transcrição reversa) foi utilizada para obtenção das amostras de cDNA. A mesma foi realizada com os componentes presentes no kit Super ScriptTMIII First-Strand Synthesis Master Mix (Invitrogen®), seguindo as instruções do fabricante. Para tanto 1.000 ng de RNA foram adicionados a 50 ng de Random hexamers e 1µl de tampão de anelamento em tubos plásticos com capacidade para 0,2 ml. Os tubos foram levados ao termociclador e submetidos a uma temperatura de 65oC por 5 min, seguida de 4oC por mais 5 min.
Após esse período 10µl de First Strand Reaction Mix (10 mM MgCl2 e 1mM de
dNTPs) e 2µl de SuperScriptTMIII/RNaseOUTTMEnzyme Mix foram adicionados, os tubos foram levados de volta ao termociclador, onde permaneceram por 10 min a 25oC, 50 min a 50oC, 5 min a 85oC e 2 min a 37oC. Em seguida 5U de enzima RNaseH foram adicionadas as amostras e mantidas a 37oC por 20 min, essa enzima foi utilizada para remover as fitas do RNA molde que eventualmente não foram transformadas em cDNA. As amostras foram quantificadas em espectrofotômetro (BECKMAN®, modelo DU-640B), nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm, sendo a relação 260/280
calculada. Para estimar a quantidade de produto obtida foi utilizado o padrão em que uma unidade de densidade óptica (DO) equivale a 50 Pg de DNA por ml de solução (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). A verificação do perfil obtido pelas amostras de cDNA foi realizada através da aplicação de 4 Pl das amostra em gel de agarose a 1,5%, contendo brometo de etídeo (0,5 Pg.ml-1) e submetido à eletroforese horizontal por 2 h, a 80 V, conduzida em tampão TEB 1X (Tris 89 mM, EDTA 2,5 mM e Acido Bórico 89 mM com pH 8,3), também adicionado de brometo de etídeo (0,5 Pg.ml-1). O gel de agarose foi visualizado sob luz UV e fotodocumentado em equipamento fotodocumentador (GEL DOC 2000 – Bio-Rad®), através do software Quantity-one.
7. Ensaio de qPCR tempo real
Para a verificação das melhores condições de amplificação por PCR tempo real foi realizado uma quantificação absoluta por PCR em tempo real. Diferentes concentrações da amostra de cDNA da linhagem padrão B. thuringiensis var. kurstatki HD1 (200, 100, 50, 25 e 12,5 ng.µl-1) foram submetidas à amplificação com o fluoróforo TaqMan® (FAMTM dye-labeled). Para tanto as reações foram conduzidas em um volume final de 20µl contendo: DNA molde nas diferentes concentrações (12,5 a 200 ng), 10,0µl TaqMan® Universal PCR Master Mix (2x), 2,0µl de TaqMan® MGB probes (sonda) e água livre de ácidos nucléicos previamente esterilizada (qsp 20 Pl).
Desta forma pode-se padronizar que concentração de 200ng de cDNA foi a melhor, devido a verificação de uma amplificação precoce das amostras. Para o ensaio com as diferentes concentrações de sonda pode-se verificar que a utilização de 2,0µl aumentou a especificidade e a eficiência da reação.
Após a determinação das melhores condições foi realizado uma quantificação relativa por PCR em tempo real paras os genes cry1Ab e cry1Ac, em comparação ao gene fabI que foi utilizado como controle endógeno. Para tanto as reações foram realizadas para os isolados positivos, em triplicatas em placas ópticas. O ciclo utilizado foi o ciclo automático do aparelho (default PCR thermal cycling conditions) onde as amostras foram submetidas a 50oC por 2 min, 10 min a 95oC e 40 ciclos constituídos de 15 s a 95oC e 1 min a 60oC, para extensão e captação da fluorescência.
8. Análise dos resultados de qPCR
A análise dos resultados de expressão quantitativa dos genes estudados foi realizada pelo software RQ Study, cujo qual está acoplado ao computador do aparelho ABI (7500). Este software realiza uma comparação entre os valores Ct (cycle threshold) das amostras e utiliza o método algoritmo 2-ΔΔCt para a determinação da expressão do gene alvo (LIVAK & SCHMITTGEM, 2001).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
1. Controle endógeno
Para a validação dos resultados de qPCR tempo real, fez-se necessário a determinação de um controle endógeno, que serviu como padrão normalizador para a análise das variações de expressão dos genes testados (LIVAK & SCHMITTGEM, 2001). Sendo assim foi tomado por base o trabalho desenvolvido por Yang et al. (2005), onde os autores selecionaram o gene sadI como controle endógeno para a detecção do gene cry1Ab em plantas de algodão (Gossypium hirsutum L.) geneticamente modificadas.
O gene sadI é responsável por codificar a enzima estearoil (PTN acil - carreadora) desnaturase, que apresenta uma dupla ligação na forma cis entre o carbono 9 e 10 da família dos ácidos graxos C18 gerando ácido oléico monoinsaturado. Além disso, regula a extensão da insaturação da membrana lipídica e de óleos contidos em sementes de plantas de algodão.
Nesse sentido, o gene fabI foi escolhido para o desenvolvimento dessa pesquisa. O mesmo é responsável por codificar a enzima enoil (ptn acil- carreadora) - redutase NADH - dependente e pertence a via de biossíntese dos ácidos graxos típica desta espécie bacteriana. Trata-se de um gene presente na via metabólica da biossíntese de
ácidos graxos da espécie B. thuringiensis, e tem um nível de expressão constitutivo, sendo compatível como controle para os genes cry que foram avaliados neste trabalho.
Todos os isolados de B. thuringiensis foram positivos para o gene fabI, pois apresentaram bandas em gel de agarose 1,5% de tamanho equivalente ao esperado (250 pb), indicando que o mesmo pode ser utilizado nas reações de qPCR tempo real como controle endógeno (Figura 1).
Figura 1. Eletroferograma da amplificação das amostras de B. thuringiensis com o iniciador fabI. MM- marcador molecular, 1 a 15 - isolados de B. thuringiensis, 16 - B. thuringiensis var.
kurstaki HD1, 17 - B. thuringiensis var. tolworthi e 18 - Controle negativo da reação.
2. Isolamento do RNA
Duas diferentes horas de incubação foram definidas para obtenção do RNA, sendo 6 horas e 30min de cultivo e 8 horas de cultivo. Em ambas as horas as bactérias estavam em sua fase de desenvolvimento estacionária, sendo a primeira no início da fase log e a segunda ao final.
Nos eletroferogramas do RNA em gel de agarose, foram visualizadas duas bandas bem definidas contendo aproximadamente 2904 e 1542 pb, que correspondem ao 23S e 16S rRNA, respectivamente (Figura 2). Na quantificação por espectrofotômetro, as amostras de RNA que apresentaram razão de 260nm e 280nm entre 1,7 e 1,8, foram consideradas aptas para a posterior síntese de cDNA. Esta
MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
relação permite uma estimativa de pureza da amostra. Preparações puras de RNA têm DO260/DO280 de 1,65 a 2,0 (SAMBROOK & RUSSEL, 2001).
Figura 2. Eletroferograma de diferentes amostras de RNA extraído de B. thuringiensis nos dois horários pertencentes à fase logarítmica.
3. Obtenção do cDNA
As amostras de cDNA foram quantificadas em espectrofotômetro e as que apresentaram razão de 260nm e 280nm entre 1,7 e 2,0, foram consideradas aptas para serem submetidas a análise de qPCR tempo real. Esta relação permite uma estimativa de pureza da amostra. No eletroferograma, pôde-se observar um arraste de bandas que foram obtidos pela amplificação por RT-PCR, com a utilização de “random primers” (Figura 3).
23S rRNA 16S rRNA
Figura 3. Eletroferograma referente ao cDNA obtido para as amostras. MM – marcador molecular, 1 a 5 - amostras de cDNA para diferentes isolados de B. thuringiensis e 6 – controle negativo da reação.
4. Quantificação relativa da expressão do gene cry1Ab
A análise de expressão do gene cry1Ab foi realizada para dois isolados e para as duas linhagens padrão positivas para o gene na reação de PCR convencional, de acordo com a Tabela 1. O valor Ct do gene cry1Ab obtido para cada amostra foi descontado do valor Ct obtido para o gene fabI, normalizando assim o valor da amostra com o controle endógeno. Em seguida, esse valor foi descontado do valor do calibrador, que para esta análise foi utilizado o valor obtido para a linhagem padrão var. kurstaki HD1 6:30h. Os valores da taxa de expressão deste gene estão demonstrados no Gráfico 1, em valores de log10.
Gráfico 1. Taxa de expressão obtida para o gene cry1Ab nas diferentes condições e amostras testadas.
De acordo com o Gráfico 1 pode-se observar que os dois isolados de B. thuringiensis positivos para o gene cry1Ab não apresentaram expressão gênica nas condições testadas. Em relação aos padrões testados a linhagem padrão var. kurstaki HD1 com o horário de isolamento do RNA 6:30h foi utilizada como calibrador dos dados e com 8h de desenvolvimento sua taxa de expressão foi da ordem de 0,60. Para a linhagem padrão var. tolworthi foi verificada uma taxa de expressão de 1,97 e 1,83 para os diferentes horários de isolamento, mostrando que a taxa de expressão foi relativamente maior no primeiro horário de isolamento.
A taxa de expressão da linhagem var. tolworthi foi 3 vezes maior que a obtida para a padrão var. kurstaki HD1, podendo estar associada ao elevado controle das larvas de S. frugiperda das duas população testadas no capítulo 3. Os isolados R25 e
R74 e a linhagem padrão var. kurstaki HD1 controlaram com eficiência a população de
laboratório e não controlaram a população de campo; já a linhagem var. tolworthi controlou com eficiência as duas populações testadas. Isto sugere que os elevados níveis na taxa de expressão do gene cry1Ab está ligada ao elevado controle de larvas de S. frugiperda.
5. Quantificação relativa da expressão do gene cry1Ac
A análise de expressão do gene cry1Ac foi realizada para os 15 isolados e 2 linhagens padrão positivas para o gene na reação de PCR convencional, de acordo com a Tabela 1. O valor Ct do gene cry1Ac obtido para cada amostra foi descontado do valor Ct obtido para o gene fabI, normalizando assim o valor da amostra com o controle endógeno. Em seguida, esse valor foi descontado do valor do calibrador, que para esta análise foi utilizado o valor obtido para o isolado R123 6:30h. Os valores da taxa de
expressão deste gene estão demonstrados no Gráfico 2, em valores de log10.
De acordo com o Gráfico 2 pode-se observar que os 15 isolados de B. thuringiensis positivos para o gene cry1Ac apresentaram expressão gênica em pelo menos uma das condições testadas. A menor taxa (- 0,44) foi observada no isolado R240
com o horário de 8h, onde o gene apresentou-se sub-expresso, e a maior taxa de expressão foi constatada para o isolado R248 com o horário de isolamento equivalente
Não foi constatada expressão do gene cry1Ac na linhagem padrão var. kurstaki HD1 para as condições testadas. Para a linhagem padrão var. kurstaki HD73, foi verificada uma alta taxa de expressão, sendo esta da ordem de 4,39 e 4,33 para os horário 6:30h e 8h, respectivamente.
Dentre os isolados analisados, taxas de expressão superiores a 3,5 foram constatada em seis isolados, em pelo menos um horário de isolamento, sendo estes: R26, R155, R230, R248, R273 e R277. Esses foram descritos no Capítulo 3, como altamente
eficientes no controle da população de laboratório e apenas o isolado R248 não foi
eficiente para o controle das larvas da população de campo. O controle de larvas de S. frugiperda está diretamente ligado à taxa de expressão dos gene cry1, e que apenas a detecção desse gene não é indicativo de que a utilização de um isolado que o contém resultará num controle eficiente da praga.