Transformasjon av E. coli

O DNA plasmidial dos 4 prováveis clones positivos extraídos através dos métodos descritos pelo kit Wizard Miniprep® e de lise alcalina empregados de acordo com o descrito em II.2.7, foram inicialmente considerados de boa qualidade e adequados para as análises de restrição e seqüenciamento. As amostras de DNA plasmidial extraídos pelo kit e pelo método de lise alcalina apresentaram neste caso concentrações de 150 e 80 ng µL-1_{, respectivamente.}

133 A análise de restrição empregando as enzimas NdeI e XhoI foi realizada a fim de confirmar a presença do inserto nos clones selecionados. A Figura 43 apresenta o perfil de restrição destes nove clones selecionados.

Figura 43. Análise de restrição dos plasmídeos pGEM-aroC. A coluna 1 é o padrão de massa molecular 1 Kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. As colunas 2 a 5 são os clones selecionados. O meio de separação foi gel de agarose 1 % em tampão 1x TAE, pH 8,3. A voltagem aplicada na separação foi 100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram corados com brometo de etídeo e visualizados em transiluminador UV a 365 nm. As bandas específicas dos genes XfaroC e dos plasmídeos digeridos estão representados por setas cujos tamanhos são aproximadamente 3000 e 1125 pb, respectivamente.

A presença e o tamanho do inserto correto foram confirmados apenas em dois dos 4 clones selecionados. Assim, os clones 2 e 4 localizados na 3ª e 5ª canaleta do gel puderam confirmar o sucesso das etapas de clonagem e transformação das bactérias. Os produtos da digestão de aproximadamente 1000 pb correspondente a ORF aroC foram retirados do gel, purificados utilizando-se novamente o kit Wizard PCR Clean-up, quantificados e utilizados na etapa de subclonagem nos vetores de expressão. Estas amostras de DNA apresentaram em geral concentrações variando de 150 a 200 ng µL-1_.

1 2 3 4 5

pb

3000

134 Os DNAs plasmidias selecionados para o seqüenciamento também foram os clones 2 e 4. Os resultados do gel de seqüenciamento para estes clones foram de baixa qualidade apresentando pouca eficiência na leitura das bases. Assim, não permitiram a certificação de que o gene correspondia exatamente a ORF de interesse. Em vista disso, o seqüenciamento dos plasmídeos contendo o gene ligado no vetor de expressão pET28a foi posteriormente realizado a fim de garantir sua identidade.

III. 2.2 – Subclonagem no Vetor de Expressão, Análise de Restrição e Seqüenciamento dos Plasmídeos Recombinantes

Os fragmentos de DNA de 1125 pb que codificam para a proteína rXfaroC foram subclonados nos vetores pET28a. Esta nova construção denominada pET- XfaroC também foi escolhida devido a expressar a proteína de interesse fusionada com uma cauda de seis histidinas na região N-terminal. Novamente, os plasmídeos recombinantes recém construídos foram inseridos por choque térmico em bactérias de E. coli DH5α competentes, semeadas em placas semelhantes ao processo anterior, porém somente com adição de canamicina como agente seletivo, e finalmente incubadas para o crescimento. A seleção das colônias neste caso foi realizada pela análise de restrição.

Após o período de crescimento celular, quatro colônias foram selecionadas aleatoriamente dentre as inúmeras colônias presentes na placa de Petri, e inoculadas seguindo o mesmo processo descrito anteriormente. Após o crescimento individual destas células seus DNAs foram extraídos, quantificados e alíquotas destes DNAs foram clivados pelas enzimas de restrição e submetidas

135

pb 5000

1000

1 2 3 4 5

novamente ao sequenciamento. Estas amostras de DNA também apresentaram concentrações variando de 120 a 150 ng µL-1_{. A Figura 44 ilustra o novo perfil de}

restrição destes quatro clones selecionados.

Figura 44. Análise de restrição dos plasmídeos pET-XfaroC. A coluna 1 é o padrão de massa molecular 1 Kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. As colunas 2 a 5 são os clones selecionados. O meio de separação foi gel de agarose 1 % em tampão 1x TAE, pH 8,3. A voltagem aplicada na separação foi 100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram corados com Brometo de etídeo e visualizados em transiluminador UV a 365 nm. As bandas específicas da XfaroC e dos plasmídeos digeridos estão representados por setas.

Uma vez confirmada a presença do inserto nos quatro clones selecionados, as etapas de subclonagem e transformação das bactérias foram consideradas bem sucedidas. Apenas os os clones 1 e 2 (equivalentes as 2 a e 3 a canaleta do gel) que apresentaram maior intensidade de banda, foram utilizados para transformar as células competentes de expressão de E. coli BL21(DE3). A seleção de dois novos clones contendo as ORFs subclonadas nos vetores de expressão foi realizada após o plaqueamento das células em meio adequado. Finalmente, um inóculo destes

136 clones foi empregado na produção da proteína recombinante em células de E. coli BL21(DE3).

As seqüências obtidas a partir do seqüenciamento foram analisadas através do programa Sequencing Analysis V 3.4. A Figura 45 ilustra a seqüência resultante de um dos clones submetidos ao seqüenciamento.

1 TCAATGCNTT GCGTCGCATG CTCCCGGCCG CNTGGCGGCC GCGGGAATTC GATTGGAATT CCATATGGGG 2 GCGAACACGT TTGGAAAGTT ACTGGCGGTC ACGACCTTCG GTGAATCACA TGGCCCTGCC ATTGGCTGTG 3 TGATTGATGG CTGTCCTCCC GGATTGGAAC TCGCTGCTGA GGAGTTTGCC CACGACTTGC AGCGTCGCGC 4 TACCGGTAGG AGCCGTCATA CCTCGGCGCG GCGTGAGGCC GATGAAGTCG AGATTCTCTC CGGCGTCTAC 5 GAAGGCCGTA CCACGGGCAC TCCTATTGCA CTGTTGATCC GCAATACCGA CCAGCGTAGT AAGGATTATG 6 CGACGATTGC CCGGCAGTTC CGTCCGGGCC ATGCCGATTA CACCTATTGG CAGAAATATG GTATCCGTGA 7 TCCTCGTGGT GGTGGGCGTT CTTCGGCCCG TGAGACAACA ATGCGTGTGG CTGCTGGGGT GGTTGCTAAA 8 AAGTGGCTGA AGCAGCGTTA TGGTGTGATT GTGCGCGGTT TTTTATCCCA GCTTGGTGAG ATCCGCCCGG 9 AAGGCTTTGC TTGGGATGCG GTCGAAGATA ATCCTTTTTT CTGGCCGCAG GCGGCTCAGG TGCCAGAGCT 10 GGAAGCCTAC ATGGATGCAT TGCGCAAATC TGGAAATTCN GTCGGTGCAC GCTGGATGTG GTTGCCGAAG 11 GCGTGCCGCC AGGGTGGGGT GAGCCGATTT ACGGCAAGCT TGATGGTGAA CTTGCTGCTG CGTTGATGAG 12 TATCAACGCA GTAAAAGGTG TGGAGATCGG CGCTGGTTTC GGCAGCACTG TACAAAAAGG AACCGAGCAC 13 CGTGATTTGA TGACACCGTT AGGTTTTCTC AGTAACCATG CTGGCGGCAT CATCGGTGGG ATCACCACTG 14 GTCAGCCGAT TATTGTTTCG ATTGCTCTGA AACCAACATC TAGCCTACGT TTGCCTGGCG AGACGGTGGA 15 TGTGGATGGC CACCCTGTCC AAGTGATCAC CAAGGGACGT CATGATCCTT GTGTGGGGAT TCGTGCCCCT 16 CCGATTGCTG AAGCCATGGT CGCGTTAGTA CTGATGGACC AGGCGCTGCG CCACCGTGCC CAGTGTGGCG 17 ATGTCGGTGA GATGTCTCCG TGCATCCTTG AGAATGTGGG TTTCAGGAAT GCCGATGATT GACTCGAGCG

18 GAATCACTAG TGAATTCGCG GCCGCCTGCA GGTCGACCAT ATGGAGAGCT CCCAANGCGT TNGAT

Figura 45. Seqüencia obtida do plasmídeo pET-XfaroC extraído do clone 3. As bases em vermelho correspondem a ORF aroC que codifica para proteína corismato sintase. As bases em negrito e sublinhado são correspondentes às seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores. Os nucleotídeos em negrito preto foram são os não identificados pelo seqüenciador.

As seqüências resultantes foram submetidas a um processo de busca por similaridade em diversos bancos de dados internacionais, através de servidores de busca disponíveis na rede. O principal programa utilizado foi o software público BLAST onde os resultados mostraram similaridade de seqüência variando de 99%

137 de identidade frente à cadeia nucleotídica correspondente a ORF deste estudo, confirmando a presença da região alvo desejada.

De modo geral os clones seqüenciados apresentaram pequenas variações entre si, que podem ser atribuídos a erros de leitura ou mesmo a erros gerados durante a marcação para o seqüenciamento. No entanto, os plasmídeos pET28a- XfaroC sequenciados apresentaram os genes de interesse inseridos na orientação e com fase de leitura corretas dentro dos vetores pET28a garantindo assim a integridade destes clones e a leitura eficiente de todas as bases dos fragmentos na etapa de expressão protéica.

III. 2.3 – Expressão Heteróloga da Proteína rXfaroC a partir dos