Transfer of transposons to A. vinelandii, measurement of promoter

interface eletrônica e micro computador). Abaixo, em detalhe, a câmara experimental mostra o orifício onde ocorre à formação da bicamada lipídica.

Para esclarecer a importância da localização das cargas elétricas no lume aquoso do poro, a molécula da α-HL do Staphylococcus aureus foi modificada, por mutagênese sítio-dirigida, para trocar um aninoácido, em varias posições, por uma cisteína, originando vinte e quatro mutantes.

As moléculas da toxina mutante foram usadas para formar canais em bicamada lipídica plana. Algumas propriedades biofísicas do canal formado por cada mutante, foram estudadas. Os grupos sulfridila (SH) foram posteriormente modificados, por interação com reagentes específicos, para criar na posição uma carga elétrica positiva ou negativa.

O primeiro canal formado por mutante da α-HL, a G130C, onde uma glicina, tendo sido substituída por uma cisteína na posição 130, foi por nós estudada, durante o mestrado em Biofísica na Universidade Federal de Pernambuco. Naquele

período, realizamos um estudo das propriedades fundamentais do canal formado pela G130C, em membranas artificiais (bicamada lipídica plana) e em eritrócitos de coelhos. Os dois métodos de estudos apresentaram os mesmos resultados, o que mostrou ser a técnica de bicamada lipídica plana bastante eficaz. Os dados obtidos foram, então, comparados aos do canal formado pela α-HL nativa. Os resultados experimentais revelaram que a substituição de um único aminoácido da estrutura primária da molécula provocara consideráveis modificações nas propriedades biofísicas do canal. Esses resultados foram publicados em periódicos internacionais (Krasilnikov O.V. et al., 1997 a,b).

Ao término do trabalho, novas mutantes estavam sendo produzidas, e o desejo de continuar investigando era muito, mas foi frustrado por vários motivos: a Universidade Federal de Pernambuco não tinha um programa de pós-graduação em nível de doutorado e, por motivos familiares, não poderia cursá-lo em outro centro acadêmico; o Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, no qual sou lotada e desempenho minhas funções acadêmica, encontrava-se com carência de professores e contava com o meu retorno.

Contudo, como docente da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, tenho acompanhado, nos últimos anos, o empenho e esforços, por parte da Instituição e, em particular do Departamento de Biofísica e Farmacologia, do qual eu faço parte, em investir na titulação de seus professores em níveis acadêmicos mais elevados. Reconhecemos que, o saber e a qualidade da Universidade, só atingem o seu máximo quando cada docente concretiza seus graus acadêmicos, e estes conhecimentos são repassados de imediato para a sociedade como um todo, através do ensino da graduação, da pesquisa e da extensão.

Com a criação do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde (PPGCSA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, de caráter multidisciplinar, vi a oportunidade de sanar os anseios e, finalmente, dar continuidade ao trabalho de pesquisa e obtenção da titulação desejada e necessária para o desempenho acadêmico.

O primeiro passo foi entrar em contato com o Doutor Oleg Vladimirovic Krasilnikov, professor da Universidade Federal de Pernambuco, pesquisador de renome internacional, com o qual tive a honra de trabalhar e ser orientada como aluna do mestrado. Assim, falei dos meus anseios em realizar este trabalho e a disposição de dar continuidade, em parte, ao trabalho de mestrado. Com o aceite, por parte do referido Doutor, tratamos de credencia-lo junto ao programa e tendo sido aprovado, submetemos o projeto de pesquisa intitulado “Papel da localização da carga em determinação dos parâmetros do canal iônico”, como pré-requisito para a seleção em nível de doutorado.

Para a execução deste projeto, contávamos com o Laboratório de Biofísica das Membranas do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, o qual possuía alguns equipamentos básico tais como: balança, medidor de pH (pH-metro), um osciloscópio, gerador de funções, ultras som, computador, Freezer, microscópio, estereomicroscópio, conversor corrente-voltagem, câmara experimental e uma placa de aquisição de dados. Logo no inicio quando ainda estávamos para desenvolver os experimentos pilotos, ficamos sem o osciloscópio, uma das nossas principais ferramentas de trabalho. Assim, surgiu mais uma dificuldade para a execução do projeto que, em virtude da exigüidade de recursos, não se tinha como adquirir novos equipamentos, melhorar os já existentes e custear a compra de reagentes.

Em contato com o Professor Krasilnikov, o mesmo disponibilizou o laboratório de Biofísica das Membranas do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da Universidade Federal de Pernambuco, do qual é o chefe da equipe, para que fossem realizados os primeiros experimentos. A oportunidade foi imprescindível para o treinamento e aprendizado das técnicas empregadas na investigação, para a familiarização com os novos equipamentos e para a definição dos protocolos. Após esta etapa, a pesquisa continuaria na Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Obtive meu afastamento e, embora sem nenhuma ajuda financeira por parte da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, desloquei-me para Recife, custeando todas as despesas inerentes a passagens e estadias.

Cumprida a primeira etapa, e como as dificuldades apresentadas no inicio não tinham sido sanadas, não tínhamos meios para dar continuidade ao trabalho na Universidade Federal do Rio Grande do Norte. E, mais uma vez, para a realização deste trabalho, contamos, com o apoio decisivo da Universidade Federal de Pernambuco, através do Departamento de Biofísica e Radiobiologia e em particular do Laboratório de Biofísica das Membranas e do Professor Krasilnikov e da sua equipe. Assim, foram proporcionadas todas as condições favoráveis ao desempenho da pesquisa, desde a disponibilidade de instalações, equipamentos, até custeio das despesas inerentes aos produtos químicos, lipídios, proteínas e reagentes utilizados no desenvolvimento dos experimentos, já que o Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte não dispunha de recursos para co-participar.

Apesar de todas as dificuldades apresentadas é importante ressaltar que todas as etapas previstas na execução do projeto foram atingidas.

Antes de iniciarmos a nossa investigação do “papel da localização das cargas em determinação dos parâmetros do canal iônico”, desenvolvemos

um outro trabalho intitulado: “O mecanismo da influência de eteres de coroa sobre o canal iônico”, no qual o canal, formado pela α-HL selvagem, foi utilizado como modelo. Esse trabalho nos proporcionou conhecer os aprimoramentos da técnica, manuseio de novos equipamentos e adequação do desempenho experimental, que, posteriormente, nos serviram de base para melhor execução e compreensão dos resultados no desenvolvimento do projeto inicial.

Além desses benefícios, os resultados obtidos foram publicados em periódico em nível internacional (anexado em outras publicações) e apresentados em congressos nacional e internacional.

Portanto, com o domínio da técnica e com o conhecimento da metodologia testada, foi possível aplicá-los no desenvolvimento do estudo proposto no projeto inicial, o que possibilitou alcançar os objetivos traçados.

Algumas investigações foram feitas, anteriormente, para descrever teoricamente, as propriedades do canal formado pela α-HL, através de estudos qualitativos (Krasilnikov et al., 1989; Misakian et al., 1997) e de aproximação quantitativa (Noskov, S.Y. et al., 2004). Os quais sugerem que a carga fixa no interior do poro, ou próximo à entrada deste, afeta as propriedades do canal.

Para investigar esses aspectos do poro, em detalhe, a técnica de escaneamento pela mutagênese da cisteína, foi utilizada para o canal heptamérico, formado pela proteína α-HL do Staphylococcus aureus. Vinte e quatro mutantes da proteína α-HL foram produzidas pela substituição de um único aminoácido, em várias posições, pela cisteina. Além disso, as consequências eletrofisiológicas, decorrente das substituições foram por nós avaliadas, após a formação do canal em uma membrana lipídica plana.

As mutantes examinadas foram divididas em três grupos: as mutações que foram feitas na região “copal” da molécula da proteína α-HL (I7C e D108C) e os outros dois grupos foram as mutantes contendo uma cisteina, introduzida nas posições pares (G126C, D128C, G130C, Y118C, F120C, G122C, V124C, I132C, G134C, I136C, A138C e V140C) e nas posições impares (T129C, K131C, G133C, N12lC, D127C, L135C, G137C, N139C, S141C e G143C) da região “troncular” do canal.

fig 07 - canal da α-HL, mostrando a posição de alguns aminoácidos ao longo do canal

Das vinte e quatro mutantes examinadas, apenas seis, as quais estão localizadas próximo da abertura trans (mutações nas posições 126, 128, 129, 130, 131 e 133 da região “troncular”), apresentaram grande influência sobre a condutância do canal. As mutações feitas nas posições impares, mas que estão afastadas da abertura trans, tiveram uma pequena, porém significante influência na condutância do canal. As mutações nas posições pares afastadas da entrada trans apresentaram uma influência mínima, ou seja, praticamente desprezíveis.

Esses resultados sugerem a importância tanto da carga, como da sua localização no lume do poro aquoso, sobre as propriedades do canal iônico. E, para certificarmos sobre estes efeitos, a cisteína introduzida foi então alterada quimicamente por reagentes específicos para o grupamento SH (sulfridila) visando introduzir na posição uma nova carga elétrica positiva ou negativa.

Neste estudo nós demonstramos experimentalmente como a intensidade da influência da carga depende de sua posição ao longo do eixo longitudinal do canal, e como esta se correlaciona com a geometria do mesmo. Os resultados permitem-nos às seguintes principais conclusões: a seletividade e a assimetria da dependência condutância-voltagem (GV) do canal da α-HL, dependem da força iônica. Este fato indica que as cargas, que reveste a face aquosa no interior do poro de dimensões nanoscópicas, ainda “sentem” as propriedades da solução banhante da bicamada lipídica, ou seja, efeitos da força iônica e do pH.

Assim os reagentes específicos para o SH (solúveis em água) foram capazes de mudar as propriedades do canal pré-inserido, formado pela proteína α-HL mutante.

Entretanto, as mudanças foram observadas apenas para as mutações em que as substituiçôes pela cisteína foram realizadas nas posições impares, da molécula da α-HL. O mesmo não foi notado quando as mutações foram feitas nas posições pares, com exceção da mutação G130C (localizada próximo da abertura trans) que teve suas propriedades mudadas pelos reagentes. Esses resultados confirmaram a estrutura β-pregueada da região “troncular” do poro em pleno funcionamento.

As mudanças nas propriedades de um canal pré-inserido é resultado da introdução de uma carga fixa localizada na parede do lume aquoso do canal.

A eficácia da carga introduzida é dependente do tipo e da localização ao longo do eixo do canal.

Os efeitos provocados pela ação destes reagentes SH podem ser revertidos pelo DTT que reverte parcialmente à ação das cargas.

A introdução de uma nova carga negativa na parte trans do poro (do domínio “troncular”) converte a seletividade do canal de pouco aniônico para catiônico, enquanto que, a introdução de uma carga positiva, aumenta a seletividade a anion.

A intensidade destas alterações foi inversamente dependente do raio do canal no local carga introduzida. Tudo indica que a malha de carga da parede interna do poro aquoso seja responsável pela seletividade do mesmo, e que as cargas nas entradas do canal é o fator determinante do perfil da curva condutância-voltagem.

Um aumento da assimetria da curva GV foi encontrado nos canais formados pelas mutantes, em que uma carga positiva e ou resíduo neutro, foi substituída pela fraca carga negativa da cisteína.

A introdução de uma forte carga negativa MTSES (pelo processo da alteração química) aumentou a assimetria da curva GV, especialmente se estava localizada próximo da abertura trans do poro. Entretanto, quando a introdução foi de uma forte carga positiva – MTSET (reagente específico ao grupo SH, com carga elétrica positiva) ocorreu diminuição da assimetria. Este resultado corrobora a importância, da carga elétrica e da sua posição na determinação da assimetria da curva.

Por outro lado, quando a introdução de uma forte carga negativa – MTSES (reagente específico SH, com carga elétrica negativa), foi na região “Copal” (lado cis do poro) esta provocou diminuição da assimetria. Logo a incorporação de carga positiva afetou as propriedades do canal de maneira oposta.

Com os resultados obtidos neste trabalho, esperamos que eles possam contribuir com outros estudos sobre poros aquosos de dimensões nanoscópicas em membranas biológicas ou artificiais, e principalmente, em aplicações na biotecnologia, quando o canal da α-HL é muito utilizado como detector de moléculas, como toxinas, polímeros, DNA.

6 – ANEXOS

6.1 – Outras Publicações

6.1.1 – Artigo 1 – Protein electrostriction: a possibility of elastic deformation of the α- hemolysin channel by the applied field

Periodico: - Eur Biophys Journal Estatus da publicação: - Publicado Qualis: - A inernacional

6.2 – Participação em Congresso

6.2.1 – The Mechanism of Crown Ethers Influence on Ion Channels Capistrano, M.F.P.; Merzlyak, P.; Yuldasheva, L.: Krasilnikov, O. Apresentado sob a forma de painel na XVII reunião Anual da FeSBE Salvador Bahia (2002)

6.2.2 – Does the electric field evoke on elastic defornation of ion channel being in high conductancestate experimental approach.

Oleg V. Krasilnikov: Petr G. Merzlyak; Lillya N. Yuldasheva, and Maria F. Capistrano.