Embora a medição de enzimas seja perfeitamente viável para os cladóceros, o uso deste grupo taxonômico tem sido relativamente negligenciado em pesquisas com biomarcadores (De Coen et al., 2000), principalmente para as espécies de regiões tropicais. Os cladóceros oferecem algumas vantagens práticas nos estudos que utilizam tal abordagem, tais como (De Coen et al., 2000; Depledge e Fossi, 1994; Lagadic, 1999): (1) são importantes componentes das cadeias alimentares, sendo que uma redução significante nas suas populações pode indicar importantes consequências ecológicas; (2) constituem populações numerosas e amostras ambientais de indivíduos podem ser tomadas rapidamente para a análise sem que ocorra um impacto significante nas populações; (3) é possível dentro de um curto período de tempo correlacionar as respostas bioquímicas e fisiológicas com os efeitos danosos em níveis populacionais e de comunidade, uma vez que os cladóceros possuem um ciclo de vida relativamente curto, um tamanho corporal pequeno, uma taxa reprodutiva alta e um curto tempo de geração; e (4) questões éticas e legais favorecem seu uso.
Entre os diferentes biomarcadores que são utilizados nos estudos com os cladóceros podem-se destacar as colinesterases, que são um importante biomarcador bioquímico para substâncias anticolinesterásicas. Uma revisão detalhada das colinesterases segue abaixo.
1.4.3.1. Colinesterases
As esterases são tipicamente subdivididas em duas principais classes de acordo com sua reatividade com alguns substratos artificiais (Peakall, 1992). As esterases do tipo “A” caracterizam-se por hidrolisar p-nitrofenil acetato em taxas maiores do que o p-nitrofenil butirato, enquanto que as esterases do tipo “B” hidrolisam o p-nitrofenil butirato na mesma taxa ou em taxas maiores que o p-nitrofenil acetato (Peakall, 1992).
As colinesterases (ChE) representam uma subclasse das esterases do tipo “B”, conjuntamente com outras esterases e carboxilesterases. Elas são caracterizadas pela presença de um sítio aniônico e um sítio ativo (esterase), sendo enzimas essenciais para o funcionamento normal do sistema nervoso central e periférico e amplamente distribuídas em tecidos neurais e não neurais (Fribroulet et al., 1990; Peakall, 1992). Dois tipos de colinesterases são reconhecidos em vertebrados e de acordo com suas propriedades catalíticas a determinados substratos e com suas taxas de inibição a determinados inibidores específicos (Eto, 1974; Hyne e Maher, 2003; Walker et al., 2001) são divididas em:
1) Acetilcolinesterase (AChE): é altamente específica para o substrato acetilcolina e fortemente inibida por BW284C51. A acetilcolina (ACh) é responsável pela transmissão do impulso nervoso a partir dos terminais dos nervos motores aos músculos, bem como na transmissão sináptica entre as células nervosas. A hidrólise da acetilcolina é catalisada pela AChE, produzindo acetato e colina como metabólitos (Fig. 1.7);
2) Butirilcolinesterase (BuChE) ou pseudocolinesterase (PChE): é uma esterase relativamente não específica que hidrolisa mais de um substrato, tais como butirilcolina e a própria acetilcolina. É fortemente inibida pela iso-OMPA. A função fisiológica da PChE é ainda desconhecida, sendo estudada em conjunto com a AChE.
Fig. 1.7 Modo de ação da acetilcolinesterase (AChE). A acetilcolina liga-se a acetilcolinesterase e é hidrolisada em
acetato (A) e colina (Ch). Fonte: adaptado de Silverthorn (2010)
Existem evidências de que uma gama de diferentes formas de colinesterases estejam presentes em uma variedade de espécies e mesmo nos indivíduos de uma mesma espécie (Habig e Di Giulio, 1991). Barata et al. (2001) não encontraram uma contribuição significativa da PChE para a hidrólise do substrato acetiltiocolina em cinco clones de Daphnia magna. Tais autores afirmaram que a atividade enzimática poderia ser referida apenas em termos de atividade da AChE. Por outro lado, Diamantino et al. (2003) constataram que as colinesterases de homogeneizados dos organismos inteiros de D. magna não podem ser classificadas nem como AChE e nem como PChE, pelo fato delas apresentarem características de ambas as enzimas.
1.4.3.1.1. A atividade das colinesterases como um biomarcador bioquímico
As colinesterases são os sítios-alvo de ação para muitos pesticidas (organofosforados e carbamatos), bem como para outras substâncias anticolinesterásicas, tais como íons metálicos (arsênio, cobre, mercúrio e zinco) (Diamantino et al., 2003), detergentes (Guilhermino et al., 1998; Lagadic et al., 1994) e cianotoxinas neurotóxicas (Molica et al., 2005; Monserrat et al., 2001), entre outros. As substâncias anticolinesterásicas inibem a atividade da AChE nas sinapses nervosas e, como consequência, ocorre um acúmulo do neurotransmissor acetilcolina no receptor pós-sináptico (Domingues et al., 2010). Por essa razão, a inibição da atividade das colinesterases tem sido utilizada como um biomarcador bioquímico, visto que a sua porcentagem de inibição pode ser utilizada como um indicador de exposição ou de efeito por um considerável período de tempo mesmo após o tóxico ser metabolizado ou eliminado do corpo do organismo (Fulton e Key, 2001; Hyne e Maher, 2003).
Considerando a existência de diferentes formas de colinesterases, a principal preocupação na sua utilização como um biomarcador é que as suas múltiplas formas podem obscurecer a correlação entre os efeitos e a inibição da atividade enzimática (Hyne e Maher, 2003). Também diferentes estágios de desenvolvimento podem gerar erros uma vez que a concentração das colinesterases varia de acordo com o estágio de desenvolvimento em que o organismo se encontra. Por isso, é essencial utilizar um material biológico com um estágio de desenvolvimento bem definido (Hyne e Maher, 2003). Algumas variáveis ambientais também têm sido sugeridas como fatores que podem interferir com a interpretação acurada das respostas da atividade das colinesterases, sendo a temperatura a principal variável ambiental (Zinkl et al., 1991). Entretanto, o uso de um controle que tenha experimentado temperaturas ambientais similares àquelas dos organismos expostos aos tóxicos pode eliminar esta fonte de variabilidade.
O monitoramento em campo da AChE cerebral de peixes e de aves constitui em uma técnica comumente utilizada para diagnosticar exposições a substâncias anticolinesterásicas (Zinkl et al., 1991). O grande sucesso na aplicação desta técnica instigou diversos pesquisadores a pensarem se as medições da atividade de colinesterases em cladóceros podem também refletir sua exposição quantitativa aos tóxicos anticolinesterásicos e capacitá-los a serem utilizados como bioindicadores. Day e Scott (1990) mediram a atividade da AChE em indivíduos de Daphnia magna quando expostos a diferentes tipos de organofosforados. No entanto, as inibições da atividade enzimática foram apenas detectadas para concentrações muito próximas àquelas consideradas letais. Guilhermino et al. (1996b) otimizaram as condições de ensaio para medir a atividade da AChE em D. magna e também avaliaram o efeito do paration, do paraoxon, do
cádmio e do 3,4-dicloroanilina (DCA) sobre a sua atividade (Guilhermino et al., 1996a). Com relação ao paration e ao paraoxon, tais autores observaram que os valores de inibição da AChE in vivo foram muito próximos àqueles encontrados a partir dos ensaios agudos convencionais. O DCA e o cádmio não tiveram nenhum efeito sobre a atividade da AChE in vivo. Printes e Callaghan (2004) observaram a existência de uma relação entre a redução na atividade da AChE e a imobilidade em D. magna, quando os dafinídeos foram expostos a diferentes pesticidas anticolinesterásicos. Estas autoras associaram uma redução de até 50% da atividade da AChE com efeitos prejudiciais na mobilidade e também concluíram que o valor do uso da atividade da AChE como um biomarcador em D. magna depende do químico testado.
Significantes avanços têm sido feitos no entendimento das interações bioquímicas de contaminantes com os organismos aquáticos (Di Giulio et al., 1995). O desenvolvimento atual das pesquisas com relação aos biomarcadores em invertebrados aquáticos já tem permitido a incorporação destas respostas como ferramentas em programas de avaliação ambiental, principalmente com relação ao uso das colinesterases (Lagadic et al., 2000; Peakall, 1999). Entretanto, pouca informação sobre a ligação entre a atividade das colinesterases e as respostas em níveis mais elevados de organização biológica tem sido obtida para os cladóceros (Duquesne, 2006; Printes e Callaghan, 2004; Printes et al., 2008), sendo que tais estudos são inexistentes para as espécies de cladóceros oriundas de regiões tropicais. Desta forma, para que as colinesterases dos invertebrados aquáticos, especialmente dos cladóceros tropicais, possam ser amplamente utilizadas em Avaliações de Risco Ecológico, mais pesquisas são necessárias no sentido de estabelecer a ligação entre a inibição das colinesterases e os efeitos tóxicos em níveis mais elevados de organização biológica para as diferentes substâncias químicas, tanto de origem natural (e.g., cianotoxinas neurotóxicas) como de origem antropogênica (e.g., pesticidas organofosforados e carbamatos).