Tilsyn

Conforme indicado acima, foi realizado validação utilizando qPCR taqman, sendo escolhidos um subgrupo de genes que foram diferencialmente expressos entre as duas fases avaliadas. A análise apresentada na Tabela 15 mostra expressão dos genes em relação ao gene constitutivo (GAPDH).

Tabela 15. Resultados qPCR usando Taqman low density array considerando a expressão dos genes antes e depois do tratamento (ΔΔCT).

Sonda_db_id Gene ztestGAPDH

média GAPDH foldGAPDH 32 THBS1-Hs00962908_m1 0.000742511 -3.27 9.62 12 CXCL5-Hs00171085_m1 7.46588E-05 -2.14 4.42 28 SMAD7-Hs00998193_m1 0.000384274 -1.35 2.54 3 ADAM28-Hs00248020_m1 0.390335343 -0.97 1.96 7 CCL22-Hs00171080_m1 0.473663054 -0.78 1.71 30 TGFBI-Hs00932747_m1 0.148688351 -0.78 1.71 31 TGFBR2-Hs00234253_m1 0.372860632 -0.64 1.56 6 BCL11A-Hs00256254_m1 0.64726475 -0.44 1.35 24 IRF1-Hs00971960_m1 0.908490638 -0.08 1.06 29 TGFB1-Hs00998133_m1 0.929997784 -0.08 1.05 8 CD40LG-Hs00163934_m1 0.823141449 0.19 0.88 11 CXCL10-Hs00171042_m1 0.780745751 0.41 0.75 20 IFITM3-Hs01635484_gH 0.360188219 0.76 0.59 21 IFNG-Hs00989291_m1 0.308399799 1.12 0.46 18 HMOX1-Hs01110250_m1 0.307610427 1.21 0.43 14 DHFR-Hs00758822_s1 0.118486913 1.47 0.36 27 LPL-Hs00173425_m1 0.182940589 1.48 0.36 22 IL10-Hs00961622_m1 0.004353981 1.56 0.34 4 APOC1-Hs00155790_m1 0.124574344 1.60 0.33 23 IL6-Hs00985639_m1 0.14782331 1.87 0.27 16 GLRX5-Hs00746721_s1 0.041894904 2.31 0.20 10 CLEC6A-Hs01073915_m1 0.63234563 2.41 0.19 25 KIF11-Hs00189698_m1 9.96392E-05 2.94 0.13 9 CDC6-Hs00154374_m1 0.027338504 3.04 0.12 13 DEFA3;DEFA1B;DEFA1-Hs00414018_m1 6.96783E-05 3.99 0.06 17 HBD-Hs00426283_m1 0.011957134 4.64 0.04 5 ARG1-Hs00968979_m1 2.2721E-08 5.09 0.03 19 IFI27-Hs00271467_m1 2.63257E-07 6.12 0.01

VI. DISCUSSÃO

Os mecanismos imunológicos envolvidos no controle ou na disseminação da Leishmania infantum em humanos não são bem compreendidos. É sabido que a infecção por leishmania pode resultar tanto em resolução da infecção, sem apresentação de sintomas, quanto em doença; no entanto, a maioria das pessoas infectadas com o parasita é resistente a desenvolver formas sintomáticas da LV, enquanto forem imunocompetentes. Embora a ausência de uma resposta antígeno específica Th1 no sangue periférico na LV sintomática possa estar relacionada com a progressão da doença, os achados de que estes pacientes apresentam elevados níveis de IFN- em tecidos, com altos níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias, sugerem que o defeito imunológico não pode ser explicado simplesmente por tolerância imunológica ou por polarização entre os dois braços da resposta imune (159). No entanto, estudos com modelos experimentais de infecção por leishmania mostraram que a presença de IL-10 resulta em susceptibilidade à infecção por L. donovani. Por outro lado, foi também, demonstrada em humanos com LV sintomática a presença de níveis elevados de IL-10 (160- 162). No nosso estudo, encontramos níveis, significativamente, elevados de IL- 10 no soro de pacientes LV com uma importante diminuição da IL-10 ao final do tratamento, conforme já demonstrado em estudos com outras populações (163). Os níveis elevados de IL-10 nestes estudos foram, no passado, associados à carga parasitária, sugerindo que esta citocina esteja correlacionada com o desenvolvimento dos sintomas na leishmaniose visceral humana. A maior carga parasitária pode ser resultante da diminuição do clearance do parasita devido à presença de IL-10, que diminui a atividade microbicida do macrófago. No entanto, ao avaliar pessoas com infecção assintomática por leishmania e com parasitemia, não encontramos níveis elevados de interleucina 10, ou seja, o nível de IL-10 não parece ser determinado pela presença de leishmania no sangue, mas parece estar relacionado a sintomatologia característica da leishmaniose visceral.

Funcionalmente a IL-10 é descrita como uma citocina moduladora, antinflamatória, na qual já foi demonstrado in vitro inibir a apresentação de antígenos por células apresentadoras, alterando a produção de citocinas do

perfil Th1 (164) e diminuindo a capacidade microbicida de macrófagos (165). O achado observado neste estudo de que há diminuição significativa no nível sérico de IL-10, entre o início e o término do tratamento, sinaliza para IL-10 como um marcador de resposta à terapêutica na LV humana, dando suporte para o uso de anti IL-10 na terapia da leishmaniose visceral. Neste estudo, observamos também os maiores níveis de IL-10 entre as pessoas expostas a Leishmania infantum, mas sem doença na área endêmica para LV. As pessoas com o fenótipo DTH-AC+, apresentam níveis de IL-10 maiores que os demais fenótipos DTH+AC-, DTH+AC+ e DTH-AC-. Pessoas com o fenótipo DTH-AC+ podem evoluir com uma variabilidade de resposta; com controle efetivo da infecção, ou tornarem-se sintomáticos (LV). Geralmente, a presença de anticorpo antileishmania está relacionada à presença de leishmania circulante. Portanto, é provável que o nível mais elevado de IL-10 nessas pessoas que ainda não desenvolveram uma resposta celular a antígenos de leishmania (DTH-), mas que apresentam anticorpo antileishmania, seja devido à presença de leishmania viável. Esse grupo de pessoas (DTH-/Ac+) poderia ser um reservatório importante de leishmania, dependendo da carga parasitária, devendo-se avaliar o papel destas pessoas na transmissão da leishmaniose.

De importância, a avaliação dos níveis de IL-10 mostrou ser mais elevados no sexo masculino quando comparados ao sexo feminino nas mesmas condições em pacientes com leishmaniose visceral sintomática. Estudos conduzidos no Brasil têm relatado um maior risco do sexo masculino, acima de 10 anos, de desenvolver LV sintomática (166). Hormônios sexuais podem influenciar diretamente na resistência ou susceptibilidade à infecção (166-169). Homens apresentam maior resposta Th2 e menor produção de citocinas do perfil Th1. Existem evidências que a testosterona, o principal hormônio androgênico circulante em pessoas do sexo masculino apresenta ação imunossupressora. Este hormônio pode reduzir a atividade de células NK, diminuir a produção de TNF e óxido nítrico pelo macrófago como suprimir a transdução de sinal pelo NFκB envolvida na produção de citocinas pro inflamatórias. Podem também promover a produção de citocinas anti- inflamatórias associadas à resposta Th2 como, por exemplo, a IL-10 e IL-4 (166;170). De uma forma geral homens tendem a ser mais susceptíveis à

leishmaniose visceral sintomática que mulheres. Esta diferença nos hormônios pode explicar a maior prevalência de doenças parasitárias no sexo masculino e a maior incidência de doenças autoimunes no sexo feminino.

A estimulação policlonal de linfócitos B resulta em hipergamaglobulinemia, com grande produção de anticorpos na LV sintomática. No entanto, essa resposta é ineficaz e estudo experimental mostrou que a IgG pode auxiliar na opsonização e internalização da leishmania em macrófagos (171). Em adição, a IL-4 preferencialmente aumenta os níveis de IgG4 enquanto a IL-10 induz os isotipos, IgG1 e IgG3 (172;173). Nos pacientes com LV foram encontrados altos níveis de imunoglobulinas, principalmente, IgG, quanto seus subtipos que podem diferir quali e quantitativamente em pacientes de acordo com área geográfica ou fatores étnicos, genéticos e da cepa da Leishmania (174). A importância destes altos títulos deve-se ao fato de não serem curativos e estarem envolvidos na opsonização da leishmania para o interior dos macrófagos. Nós encontramos altos níveis de IgG nos pacientes com LV, com os subtipos IgG1 seguidos de IgG3 na LV sintomática. Por outro lado, pessoas com infecção assintomática (DTH+) apresentam maiores níveis de IgG2. Estes resultados confirmam estudos anteriores que demonstraram altos níveis de IgG total, IgG1 e IgG3 na LV (175;176). Existe controvérsia quanto a presença da IgG2 na LV uma vez ser detectada em alguns trabalhos (177;178) e não em outros (179). Nosso grupo encontrou níveis elevados de IgG2 na LV canina, cuja doença se assemelha a LV humana (dados não publicados).

Com o advento das informações contidas em bancos de dados provenientes do sequenciamento do genoma, é possível estudar as vias metabólicas do parasita e dos hospedeiros. Os instrumentos tecnológicos atuais permitem integrações com o conjunto de informações que constituem o organismo para entendermos sua fisiologia como um todo e daí utilizar essas informações para desenvolvimento de substâncias moduladoras. Neste estudo analisamos a expressão gênica de indivíduos na fase sintomática da infecção antes do uso de terapia específica e após a recuperação. A comparação entre as duas fases mostrou a expressão diferencial de 362 genes expressos.

A expressão aumentada, do gene Hmox1 (heme-oxigenase 1) foi observada na fase sintomática da LV. Este gene codifica uma proteína, a heme oxigenase 1 (HO-1), importante em mecanismos imunoregulatórios. A HO-1 é uma enzima responsável pela degradação do heme em monóxido de carbono, ferro e bilirrubina. A HO-1 pode estar envolvida no favorecimento da infecção por leishmania uma vez que estudos demonstraram que macrófagos infectados com L. pifanoi não produzem superóxidos devido ao aumento da HO-1, impedindo assim a maturação do gp91, uma subunidade do complexo da NADPH oxidase. A ligação do heme com a subunidade gp91 é necessária para sua maturação e consequente produção de reativos do oxigênio (180). Outro estudo mostrou que a infecção por L. infantum ou o lipofosfoglicano (LPG) isolado de promastigotas desencadeia um aumento na produção de HMOX1 em macrófagos de camundongos e humanos com consequente aumento da carga parasitária (181). Estudos em camundongos com o gene HMOX1 nocauteado apresentaram uma carga parasitária significantemente menor que os camundongos selvagens. O aumento da expressão deste gene diminui tanto a produção de TNF-α quanto de intermediários reativos de oxigênio (18β). O fato de encontrarmos um aumento da expressão de HMOX1 na fase sintomática da LV pode fornecer suporte a um provável papel da heme- oxigenase na susceptibilidade à LV sintomática e uma importante ferramenta para terapia na leishmaniose.

A interação inicial da leishmania-macrófago resulta na formação de microdomínios lipídicos (Lipid rafts) que favorecem a internalização da leishmania no macrófago. A leishmania desenvolveu mais uma estratégia para facilitar a sua internalização e sobrevivência no macrófago modulando genes que estão envolvidos no metabolismo lipídico do hospedeiro. Observamos um aumento da expressão do gene APOC1 (Apolipoproteína C1) na fase sintomática da LV. Este gene é expresso principalmente no fígado sendo ativado quando monócitos são diferenciados em macrófagos, resultando em aumento da biossíntese de lipídeos nos macrófagos, levando ao atraso na fusão do fagolisossomos devido à diferença e concentrações alteradas de lipídeos envolvidos na formação da membrana, permitindo a sobrevivência dos parasitas no interior da célula.

A expressão do gene da LPL (Lipoproteína lípase) também estava elevada na fase aguda, corroborando os achados de que o colesterol está diminuído na LV sintomática. Estudos sobre o metabolismo dos lipídeos em pacientes com LV, como o possível efeito de lipoproteínas nos macrófagos infectados com leishmania, podem abrir caminhos e assim elucidar a importância de apoproteínas e de lipoproteínas na progressão da infecção. Em adição os efeitos das lipoproteínas na produção de citocinas pro inflamatórias (TNFα e IL6) e reguladoras pelos macrófagos infectados e não infectados in vitro (183) fornecem evidências de que os lipídeos plasmáticos poderiam desempenhar um papel importante no desenvolvimento e ou na manutenção da resposta imune encontrada na forma sintomática da LV. Lipoproteínas ou partículas lipoproteicas são capazes de modular a resposta imune celular. Alterações nos lipídeos plasmáticos têm sido demonstradas em algumas doenças infecciosas como na síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA) (184) e esquistossomose (185).

Alterações nos lipídeos circulantes em indivíduos com leishmaniose visceral já foram relatados (186;187). Alguns autores têm descrito que a depleção do colesterol em membranas das células do hospedeiro impede a penetração de patógenos intracelulares como Mycobacterium, Plasmodium falciparum, Chlamydia trachomatis, Listeria monocytogenes, L. donovani e L. infantum (188-194). No calazar canino, altos níveis de triglicerídeos e baixos níveis de HDL foram observados (195). Altos níveis de triglicerídeos e VLDL e baixos níveis de colesterol e, especialmente HDL foram determinados em soros de pessoas com LV, neste mesmo estudo foi observado que macrófagos incubados com HDL produziram altos níveis de IL-6 e IL-10 (196).

Nosso grupo demonstrou pacientes com doença aguda apresentando baixos níveis de colesterol total e HDL, além de, elevação nos níveis de triglicerídeos e proteína C reativa quando comparados aos pacientes controles. Os achados destes estudos sugerem que medicamentos com a capacidade de reduzir os níveis de colesterol poderiam ter um efeito importante na terapia contra infecção por leishmania (197). Por outro lado, a redução de colesterol nas membranas de células apresentadoras de antígeno, diminui a capacidade

de apresentação para linfócitos afetando a eficácia da resposta imune e assim favorecer o parasitismo.

A leishmania em contraste com seus hospedeiros mamíferos são pteridina auxotróficas e consequentemente requerem uma fonte exógena (198) de folato. Para superar esta deficiência ela desenvolveu uma rede complexa de resgate para conseguir o folato, uma pteridina que atua como cofator apenas na forma reduzida de tetrahidrofolato (H4 folato). Na leishmania como em

mamíferos o H4 folato é gerado a partir do folato e H2 folato pela dihidrofolato

redutase (DHFR) que depende do NADPH. A DHFR na Leishmania ocorre como uma enzima bifuncional associada a timidilato sintase (DHFR-TS). O H4

folato é essencial como cofator na síntese de novo do timidilato na leishmania (199). O aumento de expressão do gene DHFR na fase sintomática pode ser um mecanismo de sobrevivência da amastigota no macrófago para obter o folato.

Um alvo que consideramos interessante foi o gene arginase 1 (ARG1). O aumento da expressão ARG1 na fase aguda demonstra como a leishmania pode estar alterando o metabolismo da L-arginina do macrófago, resultando em redução da quantidade de óxido nítrico produzido, contribuindo assim para sua sobrevivência no interior do macrófago. Este gene codifica uma enzima integrante do ciclo da ureia (Krebs-Henseleit) nos animais uricotélicos sendo expressa em mamíferos e em alguns tripanossomatídeos, entre eles a leishmania. A arginase utiliza como substrato a L-arginina, produzindo L- ornitina e ureia. Outra enzima, a óxido nítrico sintase induzida (iNOS) que, como a arginase, utiliza a L-arginina como substrato, produzindo citrulina e óxido nítrico (NO) (200), é também expressa em macrófagos e a produção de NO é uma importante resposta microbicida dessas células. O NO produzido pelos macrófagos é tóxico para patógenos intracelulares, portanto, o aumento da indução da arginase e redução na indução da iNOS diminui a produção de óxido nítrico no macrófago favorecendo a leishmania e estabelecendo a infecção. Como a iNOS é dependente de L-arginina, a arginase pode atuar negativamente na regulação dos níveis de NO produzidos, consumindo o substrato da iNOS (201). Já foi demonstrado que a presença de um inibidor de arginase, a N-hydroxyl-L-arginina, diminui a capacidade de L. major em

estabelecer a infecção em macrófagos (202). Ensaios de infecção in vitro, com macrófagos transfectados com gene nocauteado, oriundos de três linhagens de camundongos, que apresentam diferentes sensibilidades à infecção por leishmania apontaram para uma baixa taxa na infectividade de macrófagos por L. (L.) amazonensis com uma cópia do gene de arginase nocauteado (203). Isso parece indicar que a arginase possa ser importante para a virulência e viabilidade do parasita na célula hospedeira. Estudos complementares deste grupo mostraram que a diminuição da síntese de ornitina, também é responsável por uma diminuição na taxa de proliferação dos parasitas, uma vez que esse composto é precursor na síntese de poliaminas e, portanto essencial para a replicação do DNA, o que indica a importância da enzima para o parasita proliferar na célula hospedeira. Com base nesses resultados, acreditamos que um dos papéis funcionais da arginase estaria relacionado com a sobrevivência do parasita no interior dos macrófagos, competindo com a iNOS pelo mesmo substrato. Estudos genéticos podem ser importantes na descoberta de genes envolvidos na rota metabólica e consequentemente na caracterização de novas vias bioquímicas com o objetivo em desenvolver novas quimioterapias uma vez que conhecemos a necessidade bioquímica e nutricional do parasita.

O recrutamento de leucócitos para o sítio de inoculação da leishmania ainda é uma área até recentemente pouco estudada. Vários estudos já evidenciaram que os fagócitos mononucleares são recrutados para o sítio da infecção. Estudos recentes indicam que os neutrófilos chegam rapidamente ao local da infecção por leishmania e liberam peptídeos antimicrobianos.. Encontramos o gene DEFA 3 com expressão elevada na fase sintomática. Este gene que codifica defensinas onde possivelmente podem contribuir na imunidade inata. Pertencem a uma família de peptídeos microbicidas e citotóxicos que parecem estar envolvidos na defesa do hospedeiro desempenhando um papel na fagocitose (204). Estes peptídeos são abundantes nas granulações dos neutrófilos e também encontradas no epitélio de superfícies mucosas como o do intestino e do trato respiratório. Uma variabilidade no número de cópias no gene da defensina pode contribuir na diferença de resistência individual frente a infecções (205). O gene IFI27 que

codifica o IFN-α aumentado na LV, embora tenha sido inicialmente conhecido pela propriedade antiviral, numerosas investigações posteriores mostraram que o IFN-α está envolvido na regulação do crescimento celular e no efeito imunomodulatório.

Genes ligados as vias dos IFNs são reconhecidos em influenciar na LV, alguns genes relacionados à sinalização do IFN que reportamos aqui poderão ser úteis para a compreensão da patofisiologia da leishmaniose visceral. Os interferons são potentes indutores da imunidade inata, em grande parte, pela capacidade de ativar vias metabólicas da resposta imune nas células hospedeiras. Os IFNs são o gatilho destas vias pela estimulação da expressão de diversas proteínas efetoras que trabalham coordenadamente para impedir a sobrevivência de patógenos intracelulares. Na última década uma nova família de proteínas reguladas por IFN- foram descobertas e desempenham um papel essencial na resistência a bactérias e protozoários intracelulares (206). Estas proteínas foram inicialmente chamadas de P47 GTPases recentemente passaram ao termo IRG (GTPase relacionada a imunidade). A família de genes é particularmente extensa em camundongos incluindo 23 genes separados na linhagem C57BL/6 onde 21 parecem codificar proteínas (207). A maioria dos genes em camundongos apresenta elementos que respondem ao estímulo por interferon e/ou sítios em seu promotor que medeiam ativação transcricional pelos IFNs. Em humanos apenas dois genes IRG foram encontrados: IRGC que codifica uma proteína expressa constitutivamente no testículo e IRGM que codifica uma proteína constitutivamente expressa em culturas de células incluindo algumas linhagens de macrófagos (208). A importância desta proteína foi demonstrada pelo fato da sua ausência em alguns sistemas experimentais terem levado a perda completa da resistência mediada por IFN- (209). Nós encontramos o gene IRG1 com expressão aumentada nos indivíduos curados de LV.

A Leishmania induz através de interações com monócitos e macrófagos a produção de diferentes quimiocinas que apresentam um papel importante na defesa do organismo contra patógenos e que funcionalmente tem um papel importante no recrutamento de células do sistema imune por quimiotaxia, ativação de leucócitos e hematopoiese. O recrutamento realizado pelas

quimiocinas CXC é um passo importante para o direcionamento do monócito ao tecido inflamado. Encontramos com aumento da expressão na fase de recuperação os genes das quimiocinas, CXCL 4, 5, 9 e 10. A quimiocina CXCL10 também chamada de IP-10 (interferon--inducible protein), importante quimiocina do grupo está envolvida na proteção contra infecção por L. Donovani in vivo. Camundongos BALB/c parasitados quando tratados com CXCL10 desenvolveram uma forte resposta Th1 com diminuição de citocinas imunossupressoras e células T CD4 produtoras de IL-10. Quando a CXCL10 é fortemente induzida nos momentos iniciais da infecção por leishmania há cura efetiva em camundongos B6 (210). Trabalhos prévios demonstraram que quimiocinas CXC levam a proteção contra infecção por leishmania. O tratamento exógeno com CXCL10 regula a via MAPK dos macrófagos parasitados levando a uma resposta imune protetora. A CXCL-10 é um candidato potencial na imunoterapia para a cura de LV (211).

Foi demonstrado que a proteína Trombospondina 1 codificada pelo gene THBS1, desempenha um papel importante na agregação e ativação plaquetária. As plaquetas também chegam rapidamente ao sítio da infecção onde podem modular a resposta imune quanto a processos inflamatórios através da secreção de citocinas, quimiocinas e outros mediadores inflamatórios (212). A participação das plaquetas em infecção bacteriana e parasitária tem sido muito recentemente documentada. Expressam também moléculas como CD40L e receptores Toll like que conhecidamente modulam a imunidade inata (213). A quimiocina ligante CXCL4 derivada de plaqueta é um conhecido ativador de monócitos humanos e estudos reforçam um papel de coordenação da CXCL4 no cross-talk entre as plaquetas e monócitos durante a inflamação inicial (214). A CXCL 5 também é liberada pela plaqueta ativada apresentando ação quimiotática para leucócitos. Encontramos também a quimiocina CCL22 no qual estudos recentes demonstraram uma ação rápida e efetiva em ativar plaquetas.

Essas novas tecnologias tais como as análises do perfil de expressão gênica podem trazer uma contribuição importante ao diagnóstico, prognóstico, tratamento das doenças infecciosas, conforme dados obtidos neste presente estudo sinalizam. O estudo de microarrays realizado utilizando RNA extraído

em duas fases da evolução da LV identificou vias adicionais, relacionadas a mecanismos moleculares e rotas metabólicas que levam ao desenvolvimento da doença. Considerando os genes que são expressos nas diversas fases, é possível pensar em alvos candidatos para o desenvolvimento de vacinas, testes diagnósticos e de drogas mais eficazes e com menos efeitos colaterais e