CHAPTER 3: Results
3: There is a strong sense of Somali identity
3.2.8.1 Pesquisa primária
Na pesquisa primária dos bancos de cDNA foram plaqueadas aproximadamente 50000pfu em placas quadradas de 12mm com meio NZY. Para o efeito, foram preparadas 8 alíquotas de 10µl das diluições apropriadas (em tampão SM) de cada banco e incubados com 600µl de células hospedeiras XL1-blue durante 15min. a 37ºC. Esta mistura de fagos e de células hospedeiras foi adicionada a 10ml de top agar aquecido previamente a 48ºC e colocado sobre as placas com NZY. As placas foram incubadas a 37ºC durante aproximadamente 8 horas e arrefecidas pelo menos durante 2h a 4ºC, antes de se proceder à transferência de DNA para membranas de nitrocelulose (Hybond-C, Amersham). Foram preparadas duas réplicas de cada placa. Na primeira, a membrana permaneceu em contacto com o agar durante dois minutos, tendo nesta altura sido marcada com três pontos de orientação assimétricos feitos com a ponta de uma agulha estéril. Na segunda a membrana permaneceu em contacto com o agar durante quatro minutos e foi marcada com exactamente os mesmos pontos de orientação. Após este processo, o DNA ligado às membranas foi sequencialmente desnaturado (1.5M NaCl, 0.5M NaOH), neutralizado (1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl) e, por fim, equilibrado (em 6xSSC) (soluções descritas no anexo I), tendo cada um dos passos ocorrido por imersão nas respectivas soluções durante 5min. Após este processo, as membranas permaneceram em contacto com papel Whatman® 3mm até estarem secas. O crosslink do DNA às membranas foi feito aquecendo-as a 80ºC durante 2h. As placas de NZY com fagos foram armazenadas a 4ºC até serem usadas para isolamento de potenciais placas pfu positivas.
3.2.8.2 Marcação das sondas de cdnA
As sondas produzidas em I.2.5 foram utilizadas para pesquisar os bancos de cDNA a partir de 25ng de DNA purificado e ressuspendido em 45µl de água estéril. Após desnaturação a 95º durante 5min a sonda foi adicionada à mistura de Rediprime (Rediprime random labelling kit, Amersham Biosciences, UK) seguido de 5µl de [α-32P-dCTP] cuidadosamente
misturados por pipetagem. A reacção foi incubada a 24ºC durante uma hora e o volume da reacção foi ajustado com 150µl de água estéril. A sonda marcada foi desnaturada a 95ºC durante 5min e imediatamente colocada em gelo onde permaneceu 2min antes de ser adicionada à solução de hibridação sem purificação prévia.
3.2.8.3 Pré-hibridação e hibridação das membranas
As membranas com DNA, no máximo de 8 por tubo de hibridação, foram sujeitas a pré- hibridação com aproximadamente 40ml de solução de hibridação (6x SSC, 5x Denhart´s, 0.1% SDS e 0.1mg/ml RNA de transferência: informação detalhada no anexo XX) a 65ºC durante 2h. Após este período foi adicionada a sonda marcada (0.5-2x106cpm/ml),
procedendo-se à hibridação durante a noite, durante 16 ou mais horas. Os screenings feitos às membranas preparadas em duplicado foram realizados sob condições de elevada estringência, idênticas às utilizadas durante a pré-hibridação.
Após a hibridação, as membranas foram lavadas em 0.1xSSC/0.1% SDS a 65ºC, com renovação de solução em cada 10 min até que as contagens da solução de lavagem fossem inferiores a 5 contagens por segundo (cps). Quando o sinal de fundo deixou de ser detectado nas membranas, estas foram cuidadosamente envolvidas em plástico, tendo os duplicados sido dispostos lado a lado, e expostas a um filme radiográfico (Biomax MS film – KodaK), dentro de uma cassete de revelação, a -70ºC durante um período que variou entre 1 a 3 dias.
Foram considerados como potencialmente positivos os clones que hibridaram com a sonda simultaneamente nas membranas duplicadas. Nesses casos a região correspondente
na placa de NZY foi recolhida com o auxílio de uma ponta plástica de pipeta de 1 ml invertida (Gilson pippetmann). Os fagos respectivos foram eluídos por agitação durante 4-5h em 500ml de tampão SM e 20µl de clorofórmio.
3.2.8.4 Pesquisas secundária e terciária dos bancos de cdnA
Na pesquisa secundária seguiu-se o processo descrito para a pesquisa primária e hibridação, mas neste caso as membranas foram obtidas a partir de placas preparadas através da adição de 1-5µl de uma diluição de 1:1000 dos potencialmente positivos isolados a partir da pesquisa primária, em 200µl de células hospedeiras, produzindo desta forma entre 500-1000pfu por placa. O tempo de exposição do filme que foi também ajustado para ser inferior a 3h. Os possíveis positivos foram recolhidos individualmente das placas de agar com o auxílio de uma pipeta de Pasteur de vidro e colocados dentro de 250µl de tampão SM e 10µl de clorofórmio. Nos casos em que não foi possível isolar individualmente os clones, recorreu- se a um screening terciário fazendo uma nova diluição a partir da placa de NZY secundária seguindo a mesma metodologia para isolar completamente as pfu pretendidas.
3.2.8.5 Excisão in vitro do vector pbluescript
O vector pBluescript foi excisado utilizando 100µl de solução tampão SM contendo os fagos potencialmente positivos, a que se adicionaram 200µl de células hospedeiras (XL1- Blue) e 1µl de ExAssist helper phage (> 1x106pfu/µl). A solução foi incubada durante
15min a 37ºC, após o que lhe foram adicionados 3ml de meio LB Broth (anexo II) e de novo incubada durante 2-3 horas a 37ºC com agitação. Os tubos contendo a solução foram aquecidos a 70ºC durante 20min e centrifugados a 1000g durante 15min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi recolhido para um novo tubo e 1µl desta solução adicionada a 200µl de células hospedeiras SOLR (anexo II). A mistura foi incubada a 37ºC durante 15min e 30µl desta solução plaqueada em placas de petri circulares contendo LB/ ampicilina (anexo II), que permaneceram durante a noite a 37ºC.
Foram recolhidas colónias individuais a partir das placas que serviram para inocular 5ml de meio líquido LB broth com ampicilina (50µg/ml) que foram de novo incubadas durante a noite a 37ºC com agitação. O plasmídeo foi purificado utilizando o kit de purificação de DNA Wizard Plus SV Miniprep DNA purification System (Promega). A presença do inserto e a confirmação do seu tamanho foram aferidas digerindo os plasmídeos purificados com duas endonucleases de restrição, EcoR1 e Xho1, tendo o resultado sido visualizado após separados os fragmentos por electroforese em gel de agarose 1.5% em TBE/Brometo de etídio (anexo III).
3.2.8.6 Preparação do plasmídeo, sequenciação e análise
O DNA plasmídico isolado usando o procedimento da lise alcalina (Sambrook et al., 1989) seguido de extracção do DNA com fenol. Os insertos foram sequenciados com um sequenciador automático (ABI 373) usando o primer T3 de sequenciação na região polylinker do pBluescript que flanqueia a região 5’ do inserto de cDNA. Como os bancos de cDNA foram construídos por clonagem direccional, isso implica que todos os insertos de cDNA se encontravam inseridos no vector segundo a mesma orientação. A qualidade das sequências foi avaliada e as sequências do vector e polylinker removidos. A identidade das sequências foi determinada por pesquisa com os algoritmos BlastX e Blastn (versão 2.0, National Center for Biotechnology Information, Altschul et al., 1997) no servidor http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. As coincidências foram consideradas estatisticamente significativas quando foi obtida uma identidade de sequência superior a 65% para um “score” maior que 40 e um valor de E (E-value) inferior a 10 –5 (Martins et al., 2001). Os clones positivos foram sequenciados na íntegra pelo menos duas vezes a partir dos flancos 5’ e 3’, neste caso utilizando o primer T7. As sequências foram alinhadas utilizando o software DNASIS (versão 5.0), com o qual se obteve também a sua tradução em aminoácidos. Os clones isolados neste estudo encontram-se referenciados no genebank com os seguintes códigos de acesso: AF135850 (F3BR3) and AF135851 (3OV1).