2.1 – Equipamentos e Procedimentos
• Determinação de temperaturas de fusão
As temperaturas de fusão foram determinadas em um equipamento Mettler FP 90. • Determinação de massa
As massas foram determinadas em uma balança Gehaka, modelo AG 200, precisão de 10mg.
• Análise Elementar
As análises foram feitas em um aparelho Perkin Elmer, modelo CHN-2400. • Análises Condutimétricas
As medidas de condutividade molar dos complexos foram realizadas em soluções de DMF de concentração na ordem de 10-3 a 10-4 mol L-1, utilizando-se um condutivímetro YSI Conductivity Brigde, modelo 31, com célula condutimétrica de constante 0,088cm-1 do mesmo fabricante.
• Espectros de Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de RMN foram determinados nos solventes DMSO-d6 ou CDCl3 usando-se TMS (δ=0) como padrão interno. Os espectros foram obtidos nos espectrômetros Brucker DPX200 - (200 MHz) e Brucker DRX-400 Avance - (400MHz).
• Espectros de Infravermelho
Os espectros de IV foram determinados na região 400-4000 usando-se como suporte KBr cm-1 e na região 200-650 cm-1 em placas de CsI como suporte,. Os espectros foram obtidos em um espectrômetro Perkin Elmer FT-IR System-Spectrum GX.
• Espectros de Ultravioleta-Visível e Fluorescência
Os espectros de UV-Vis foram registrados utilizando-se uma cubeta de vidro de 1 a 5 cm de caminho óptico e soluções de concentração da ordem de ~ 10-6 mol.L-1, no espectrofotômetro CARY100 Bio – (UV1006M29) – VARIAN (Agilent Technologies). Os espectros de fluorescência foram registrados no espectrofotômetro CARY Eclipse-(FL1006m016)-VARIAN (Agilent Technologies) utilizando-se cubetas de quartzo de 1cm de caminho óptico.
19 • Espectros de ressonância paramagnética eletrônica (RPE)
Os espectros de RPE foram obtidos no espectrômetro Bruker ESP300E com 100 kHz de frequência de modulação e uma amplitude de modulação de 0.4–1mT. Os espectros a temperatura ambiente, das amostras em estado sólido e as das soluções em DMSO (1 mmol L−1),
foram obtidos em capilares de vidro de 1,2 mm de diâmetro interno. Os espectros em solução de DMSO a baixa temperatura foram adquiridos na temperatura do N2 liquido (77 K) em tubos de Teflon® de 3 mm de diâmetro. Os espectros de RPE foram medidos pela Dra. Sonia Louro, do Departamento de Física, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro.
• Estruturas Cristalográficas
As estruturas cristalográficas foram determinadas em colaboração com os pesquisadores: Dr. Oscar E. Piro (Departamento de Física, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata), Dr. Eduardo E. Castellano (Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo), Dr. Nívaldo Speziali (Departamento de Física, UFMG), Dra. Isolda Maria de Castro Mendes (Departamento de Química, UFMG). Detalhes e condições experimentais de cada medida estão descritos nos capítulos que se seguem.
• Estudos de relação estrutura-atividade (SAR)
A análise conformacional das hidrazonas foi realizada usando-se o método Merck Molecular Force Field (MMFF)1 através do programa de modelagem molecular Tinker2. Foram analisadas as conformações E e Z de todos os compostos. As energias estruturais mínimas dos isômeros foram obtidas a partir de análise conformacional por meio da Teoria do Funcional de Densidade (density functional theory, DFT)3, empregando a função híbrida B3LYP4,5 e usando o conjunto de bases de elétrons 6-31G(d) em todos os átomos6,7. A fim de obter melhores propriedades e resultados de energias, cálculos de energia no ponto simples ao nível da teoria de perturbação de segunda ordem de Møller-Plesset8,9 foram então realizados para as estruturas otimizadas B3LYP/6-31G(d), usando o mesmo conjunto de bases [MP2/6-31G(d)//B3LYP/6-
1
Dewar, M.J.S.; Zoebisch, E.G.; Healy, E.F.; Stewart, J.J.P.; J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 3902.
2TINKER Software Tools for Molecular Design, 5.0, 2009: TINKER Software Tools for Molecular Design, 5.0; Jay W. Ponder Lab, Dept. of Biochemistry & Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine: St. Louis, 2009.
3Parr, R.G.; Yang, W.; Density-Functional Theory of Atoms and Molecule, Oxford University Press, Oxford, 1989. 4Becke, A.D.; J. Chem. Phys. 1993, 98, 5648.
5
Lee, C.T.; Yang, W.T.; Parr, R.G.; Phys. Rev. B. 1988, 37, 785. 6Ditchfield, R.; Hehre, W.J.; Pople, J.A.; J. Chem. Phys. 1971, 54, 724. 7Hehre, W.J.; Ditchfield, R.; Pople, J.A.; J. Chem. Phys.1972, 56, 2257. 8Møller,C.; Plesset, M.S.; Phys. Rev.1934, 46, 618.
9Szabo, A.; Ostlund, N.S.; Modern quantum chemistry. Introduction to advanced electronic structure theory, Dover Publication, Inc. New York, 1996.
20 31G(d)]. A distribuição de carga dos confôrmeros mais estáveis foi calculada usando a teoria da Ligação Orbital Natural (NBO)10,11. Todos os cálculos de mecânica quântica foram realizados através do programa Gaussiam12. As energias dos orbitais HOMO (highest occupied molecular orbital) e LUMO (lowest unoccupied molecular orbital) e os dipolos moleculares, foram obtidos depois de uma completa otimização e foram usados como descritores para estudos SAR. As estruturas tridimensionais obtidas da otimização das hidrazonas foram usadas no software Marvin13 para calcular as áreas de superfice molecular. O coeficente de partição teórico (logP) das hidrazonas foi determinado usando o programa ALOGPS 2.114. A área de superfície molecular e o logP foram também utilizados como descritores para os estudos SAR. Os estudos SAR foram realizados pelo professor William Ricardo Rocha, do Departamento de Química, UFMG.
• Reagentes e solventes
Todos os reagentes utilizados foram de alto grau de pureza e sem tratamento previo. As procedências dos reagentes foram as seguintes: acilhidrazidas e arilhidrazidas (Aldrich), cloreto de zinco(II) (Vetec), cloreto de cobre(II) diidratado (Quimis), tricloreto de n-butil estanho (Aldrich), tricloreto de fenil de estanho (Aldrich), 4(5)-imidazol-carboxaldeído (Aldrich), 4-(1H- imidazol-1-il)benzaldeído (Aldrich), 4-(1H-imidazol-1-il)acetofenona (Aldrich), 2- Benzoilpiridina (Aldrich), 2-formilpiridina (Aldrich), 2-acetilpiridina (Aldrich), acetilhidrazida (Aldrich), benzoilhidrazida (Aldrich), 4-cloro-benzoilhidrazida (Aldrich), 4-nitro- benzoilhidrazida (Aldrich), metanol (Synth), etanol (Synth), éter etílico (Grupo Química), acetona (Quimex), DMF (Synth) e (Merck), DMSO (Synth), acetonitrila (Vetec), TRIS-HCl (SIGMA), Ácido desoxirribonucléico (CT-DNA) (SIGMA-ALDRICH), Brometo de etídeo (SIGMA).
10Reed, A.E.; Weinhold, F.; J. Chem. Phys. 1983, 78, 4066. 11
Reed, A.E.; Weinstock, R.B.; Weinhold, F.; J. Chem. Phys. 1985, 83, 735.
12 Gaussian 03, Revision C.02, M.J. Frisch, G.W. Trucks, H.B. Schlegel, G.E. Scuseria, M.A. Robb, J.R. Cheeseman, J.A. Montgomery, Jr., T. Vreven, K.N. Kudin, J.C. Burant, J.M. Millam, S.S. Iyengar, J. Tomasi, V, Barone, B. Mennucci, M. Cossi, G. Scalmani, N. Rega, G.A. Petersson, H. Nakatsuji, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai, M. Klene, X. Li, J.E. Knox, H.P. Hratchian, J.B. Cross, V. Bakken, C. Adamo, J. Jaramillo, R. Gomperts, R.E. Stratmann, O. Yazyev, A.J. Austin, R. Cammi, C. Pomelli, J.W. Ochterski, P.Y. Ayala, K. Morokuma, G.A. Voth, P. Salvador, J.J. Dannenberg, V.G. Zakrzewski, S. Dapprich, A.D. Daniels, M.C. Strain, O. Farkas, D.K. Malick, A.D. Rabuck, K. Raghavachari, J.B. Foresman, J.V. Ortiz, Q. Cui, A.G. Baboul, S. Clifford, J. Cioslowski, B.B. Stefanov, G. Liu, A. Liashenko, P. Piskorz, I. Komaromi, R.L. Martin, D.J. Fox, T. Keith, M.A. Al-Laham, C.Y. Peng, A. Nanayakkara, M. Challacombe, P.M.W. Gill, B. Johnson, W. Chen, M.W. Wong, C. Gonzalez, J.A. Pople, Gaussian, Inc., Wallingford CT, 2004.
13Chemaxon, Budapest, Hungary
21
2.2 – Sínteses de ligantes e complexos
2.2.1 – Síntese de acetil, benzoil, para-cloro-benzoil e para-nitro-benzoil hidrazonas derivadas de 2-formil- (H2FoR), 2-acetil- (H2AcR) e 2-benzoil-piridina (H2BzR): (H2FopClPh, H2FopNO2Ph, H2AcMe, H2AcPh, H2AcpClPh, H2AcpNO2Ph, H2BzMe,
H2BzPh, H2BzpClPh e H2BzpNO2Ph)
As hidrazonas foram obtidas misturando quantidades equimolares (1 mmol) de 2-formil, 2-acetil ou 2-benzol piridina com a hidrazida desejada, em metanol, adicionando-se três gotas de acido acético glacial como catalisador. A mistura da reação foi mantida em refluxo durante 6 horas. Depois que a mistura reacional foi esfriada à temperatura ambiente, o sólido obtido foi filtrado e lavado com etanol e éter sob pressão reduzida15. Os compostos foram caracterizados por temperaturas de fusão, RMN de 1H, 13C, DEPT 135 e HMQC, por seus espectros de absorção na região do infravermelho e análise de difração de raios X de monocristal.
2.2.2 – Síntese de acetil, benzoil, para-clorobenzoil e para-nitrobenzoil hidrazonas derivadas de 4(5)-imidazol-carboxaldeído [4(5)ImMe, 4(5)ImPh, 4(5)ImpClPh, 4(5)ImpNO2Ph], 4-(1H-imidazol-1-il)benzaldeído [4ImBzMe, 4ImBzPh, 4ImBzpClPh,
4ImBzpNO2Ph] e 4-(imidazol-1-il)acetofenona, [4ImAcMe, 4ImAcPh, 4ImAcpClPh e
4ImAcpNO2Ph]
As hidrazonas foram obtidas mediante a mistura de quantidades equimolares (1mmol) dos derivados de imidazol com as hidrazidas correspondentes, em meio etanólico, adicionando- se três gotas de ácido acético glacial como catalisador. No caso da hidrazona de 4(5)-imidazol- carboxaldeido com a acetilhidrazida, a síntese foi feita usando acetonitrila como solvente. A mistura foi colocada em refluxo de 4 a 6 horas. Depois que a mistura reacional foi resfriada à temperatura ambiente, o sólido obtido foi filtrado e lavado sob pressão reduzida com etanol e éter.
Todos os compostos foram caracterizados por temperatura de fusão, RMN de 1H, 13C, DEPT 135 e HMQC, por seus espectros de absorção na região do infravermelho e análise de difração raios X de monocristal.
2.2.3 – Síntese dos complexos de cobre(II) e zinco(II) com as 2-formil, 2-acetil e 2-benzoil piridina hidrazonas
Os complexos foram obtidos adicionando 10 mL de solução etanólica do sal do metal correspondente (ZnCl2 ou CuCl2.2H2O) a 10 mL de solução etanólica quente do ligante, em uma
15Furniss, B. S.; Hannaford, A. J.; Smith, P. E. G.; Tatchell, A. R., Vogel´s Text-book of Practical Organic Chemistry, 5th ed.; ELBS: Longman, UK 1989, 1269.
22 relação metal-ligante 1:1. A solução formada foi mantida em refluxo por 2 horas. Depois de resfriamento à temperatura ambiente o sólido obtido foi filtrado e lavado com etanol e éter para ser secado sob pressão reduzida.
2.2.4 – Síntese dos complexos de estanho(IV) das hidrazonas derivadas de piridina e de imidazol a partir de SnPhCl3 e SnButCl3
Os compostos foram obtidos mediante a adição de uma solução do sal de estanho(IV) a uma solução etanólica quente do ligante, em uma relação metal ligante 1:1. A mistura foi mantida em refluxo por um período de 2 a 4 horas. O sólido obtido foi filtrado e lavado com etanol para ser secado sob pressão reduzida.
2.3 – Testes Biológicos e avaliação farmacológica
Os testes de atividade antibacteriana e antifúngica foram realizados nos laboratórios do Departamento de Química da UFMG.
2.3.1 – Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de macrodiluição
A atividade antimicrobiana foi avaliada mediante a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) usando o método de macrodiluição16. Para a avaliação dessa atividade foram utilizados os microorganismos Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas Aeruginosa ATCC 9070, Enterococcus faecalis ATCC 19433 e Candida albicans ATCC 18804 e 10231. S. aureus ATCC 6538 e P. Aeroginosa ATCC 9070 foram estocados no caldo Mueller Hinton Broth (MHB) enquanto que para E. faecalis ATCC 19433 foi empregado o caldo Brain Heart Infusion (BHI). Todos os microorganismos foram inoculados para serem testados no mesmo meio e cultivados a 37ºC. As células das bactérias foram suspendidas, de acordo com o protocolo McFarland17, em MHB ou BHI, para produzir uma suspensão de aproximadamente 105 UFC (unidades formadoras de colônias) mL-1. C. albicans ATCC 18804 e 10231 foi estocada em Sabouraud Broth e inoculada para ser testada no mesmo meio e cultivada a 37ºC. As células das bactérias foram suspendidas em MHB, de acordo com o protocolo de McFarland3, em uma solução salina, obtendo-se uma suspensão de aproximadamente 103 células/mL-1.
Para a avaliação das atividades antibacteriana e antifúngica uma serie de diluições sucessivas dos compostos, previamente dissolvidos em DMSO, foram feitas em tubos de ensaio; 24 horas depois o inóculo (100 µL) foi adicionado em cada tubo. A CIM, definida como a
16
National Committee for Clinical Laboratory Standards, Method for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, in: NCCLS Document M7-A6, Pennsylvania, USA, 2003, ISBN: 1-56238-486-4.
17National Committee for Clinical Laboratory Standards, Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts, in: NCCLS Document M27eMA2 NCCLS, Pennsylvania, USA, 2002, ISBN: 1-56238-469-4.
23 concentração mais baixa do composto testado que inibe o crescimento visível, foi determinada depois de 20 horas de incubação a 37ºC.
Como controle positivo foi usado a bactéria/ou o fungo no meio de cultura. No controle negativo foi usado o fluconazol, para a C. albicans; tetraciclina para o S. aureus e P. aeruginosa e ciproxacina para E. faecalis respectivamente. A concentração final de DMSO nunca excedeu 1%. Em todos os casos, não foi observada inibição com 5% v / v de DMSO. Todos os testes foram feitos em triplicata.
2.3.2 – Avaliação da atividade antifúngica pelo método de microdiluição
Os testes de atividade antifúngica pelo método de microdiluição foram feitos em parceria com a Profa. Jacqueline Aparecida Takahashi, do Departamento de Química da UFMG.
Fungos filamentosos, Cladosporium cladosporioides (LABB 6) e Aspergillus flavus (LABB 44) foram obtidos no Biotechnology and Bioassays Laboratory (LABB, MG, Brasil) e mantidos em ágar de batata (ADB) sob refrigeração a 7oC. As cepas de, Candida glabrata ATCC 2001 e C. albicans ATCC 18804 foram mantidas em meio BHI. Para a realização dos experimentos, os fungos foram cultivados em ADB ou BHI até a esporulação. Os esporos foram coletados e suspensos em água esterilizada, contados em câmara de Neubauer e diluídos de forma a se obter uma suspensão com a concentração final de 5x103 esporos/mL. A triagem inicial foi feita em micro placas para todos os compostos em uma concentração de 100 µg/poço (em DMSO). A concentração máxima de DMSO não ultrapassou 2%. Controles negativos (inóculo mais meio de cultura) e positivos (inóculo mais composto de referência, nistatina) foram feitos simultaneamente. Os compostos que mostraram atividade na etapa de triagem foram testados em uma série de microdiluição em 12 concentrações (250; 125; 62,5; 15,6; 31,3; 15,6; 7,81; 3,91; 1,95; 0,98; 0,49; 0,24 e 0,12 µg), em duplicata. A avaliação da inibição foi feita em um leitor de placas TP-reader (Thermoplate, Brazil). O valor da concentração inibitória mínima (CIM) foi definido como a menor concentração do composto que mostra 100% de inibição do crescimento do fungo, após o tempo de incubação (48h). Os valores de CIM50 foram definidos e expressos como a mais baixa concentração dos compostos capaz de inibir 50% do crescimento do fungo. Todos os experimentos foram realizados seguindo o procedimento de Zacchino e Gupta18.
18Visbal, G.; San-Blas,G. Esteroles de hongos y parásitos por cromatografía de gases y espectrometría de masas. In: Manual de técnicas in vitro para la detección de compuestos antifúngicos. Zacchino, S. A.; Gupta, M. P., Eds.; Corpus Editorial, Rosario, Argentina. 2007, 95.
24
2.3.3 – Atividade citotóxica
Os testes de atividade citotóxica em células tumorais foram realizados no Centro de Tecnologia Nuclear (CDTN) em parceria com a Dra. Raquel Gouvea dos Santos.
• Linhagens de células malignas humanas.
Foram utilizadas células do tipo gliobastoma multiforme do tipo selvagem (U87) e gliobastoma multiforme mutante P53 (T98), as quais foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, USA).
Linhagens de células foram cultivadas em monocamada em Dulbecco´s Modified Eagle’s Medium (Gibco), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab) e antibióticos (50 U/mL penicilina e 50 µmol.L–1 estreptomicina), em atmosfera úmida ar/CO2 (5% / 95%) a 37 º C. Células 80% confluentes foram usadas em todos os experimentos.
• Linhagens de células sadias
Foram utilizadas células de fibroblastos de pulmão fetal humano (MRC5) as quais foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, USA).
As células foram cultivadas em monocamada em Dulbecco´s Modified Eagle’s Medium (Gibco), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab) e antibióticos (50 U/mL penicilina e 50 µmol.L–1 estreptomicina), em atmosfera úmida ar/CO2 (5% / 95%) a 37 º C. Células 80% confluentes foram usadas em todos os experimentos.
• Método MTT
A atividade citotóxica foi verificada mediante o ensaio de brometo de 3-(4,5dimetil-2- tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) que avalia a viabilidade metabólica celular19. As células foram cultivadas em placas de 96 poços e, 12 horas depois da incubação, foram tratadas com diferentes concentrações dos compostos (1 x 10-12 – 1 x10-5 mol.L-1). Outro grupo de células foi tratado com as mesmas concentrações de etoposídeo (controle positivo), agente antineoplásico que inibe a enzima topoisomerase II. Os compostos foram dissolvidos previamente em DMSO e as concentrações finais foram ajustadas, através de uma diluição de 8 vezes em série, em DMEM de tal forma que a concentração final de DMSO foi menor que 0,5%.
Depois de 48 h de tratamento, as células foram incubadas com MTT (0,5 mg.mL-1) e os cristais de formazan foram solubilizados em DMSO. A absorbancia foi medida na leitora de microplacas a 570 nm. Testes usando DMSO (0,5% em DMEM) como controle negativo foram
25 realizados em paralelo. Os valores de CI50 foram calculados quando a concentração do composto induziu 50% de morte celular.
• Análise morfológica das celulas tumorais
Células foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com compostos de teste. Alterações morfológicas foram analisadas 48 h após o tratamento por microscopia de contraste de fase, (Nikon).
Alterações no DNA foram detectadas mediante coloração com 4',6-diamidina-2- fenilindol (DAPI). Depois de 48 h de tratamento com 10-9 mol.L-1 dos compostos testados, as células foram lavadas com PBS e fixadas com 70% de metanol à temperatura ambiente por 30 minutos. As células foram incubadas com 0,4 µg.mL-1 DAPI (Sigma) por 1 h no escuro e depois lavadas com PBS. As alterações no DNA como fragmentação e condensação de cromatina foram observadas por microscopia de fluorescência (Nikon 385-410 nm).
2.3.4 – Estudos de ligação ao DNA
2.3.4.1 – Determinação da constante de ligação por espectroscopia de absorção eletrônica
Experimentos de titulação por absorção eletrônica foram realizados em cubetas de 1 cm de caminho óptico. Concentrações fixas dos complexos (~10-5 mol.L-1) em solução tampão de Tris-HCl (pH=7,10) foram tituladas com volumes de solução de DNA (CT-DNA) no mesmo tampão até alcançar uma relação 1:1 (complexo:CT-DNA). Após cada adição o espectro de absorção foi registrado. Os dados foram ajustados com a seguinte equação20:
[DNA]/(εa-εf) = [DNA]/(εb-εf) + 1/Kb(εb-εf),
onde [DNA] e concentração dos pares de bases do DNA, εa corresponde a relação entre
Aobs/[complexo] (Aobs = absorvância observada) , εf e o coficente de extinção do complexo livre
em solução e εb é o coeficente de extinção do complexo completamente ligado ao DNA. Do
gráfico de [DNA]/(εa-εf) vs (DNA), a constante de ligação intrínseca (Kb) é calculada pela razão
entre o coeficente angular [(εb-εf)] e o intercepto [1/Kb(εb-εf)].
2.3.4.2 – Determinação das constantes de ligação por fluorescência
A constante de ligação dos complexos foi determinada mediante a análise competitiva da de interação entre soluções dos complexos e solução de brometo de etídeo (ligado ao CT-DNA) em tampão Tris-HCl (pH=7,10). O brometo de etídeo (BE) não emite fluorescência na solução de Tris-HCl. Na presença do DNA, o BE mostra emissão de fluorescência reforçada devido à
26 intercalação com o DNA. A substituição competitiva de BE do CT-DNA pelo complexo metálico provoca uma diminuição na intensidade da fluorescência. As modificações na intensidade de fluorescência a 603 nm (545 nm de excitação) depois da adição de volumes constantes de solução dos complexos foram registradas.
Primeiro calculamos a constante de supressão da fluorescência (Kq) mediante a equação de Stern-Volmer21:
I0/I = Kq [Q] + 1,
onde I0 e a intensidade de emissão em ausência do supressor, I e a intensidade de emissão na presença do supressor, Kq e a constante de supressão e [Q] a concentração do supressor. Kq é o coeficiente angular obtido do gráfico de I0/I vs [Q].
A constante aparente de ligação (Kapp) foi calculada da equação: KEB [BE] = Kapp [complexo],
onde KEB = 107 mol.L-1 e [complexo] é a concentração quando for suprimida 50% da fluorescência ou I0/I = 2 ou 1/Kq.
A constante de ligação do complexo no CT-DNA é obtida do gráfico log[(F0-F)/F] vs log [Q] na equação:
log[(F0-F)/F] = log Kb + nlog[Q]22,23,
onde F0 e a intensidade de fluorescência inicial, F e a intensidade de fluorescência depois de adição do complexo metálico, n é igual ao número de sítios de ligação e Kb a constante de ligação. A constante é obtida do intercepto da curva.
2.4 – Determinação do rendimento quântico (ΦF)
O método usado para determinar o rendimento quântico dos compostos foi o comparativo de Williams e col.24. Este método envolve o uso de amostras de padrões muito bem caracterizados com ΦF conhecidos. Basicamente, em soluções de amostras padrões e de amostras problema, no mesmo cumprimento de onda de excitação, pode-se assumir que é absorvido o mesmo número de fótons. Assim, uma razão simples da intensidade integrada de fluorescência das duas soluções (medidas em condições identicas) irá produzir a razão entre os valores de rendimento quântico.
21Lee, M.; Rhodes, A.L.; Wyatt, M.D.; Forrow, S.; Hartley, J.A. Biochemistry. 1993, 32, 4237.
22 Kandagal, P.B.; Ashoka, S.; Seeytharamappa, J.; Shaikh, S.M.T.; Jadegoud, Y.; Ijare, O.B.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 41, 393.
23Feng, X.Z.; Lin, Z.; Yang, L.J; Wang, C.; Bai, C.L.; Talanta. 1998, 47, 1223. 24Williams, A.T.R.; Winfield, S.A. and Miller; Analyst. 1983, 108, 1067.
27 • Procedimento
1. Registrou-se o espectro de UV-vis do fundo solvente para a amostra escolhida, padrão ou composto a estudar, anotar o valor da absorbância no comprimento de onda de trabalho. 2. Registrou-se o espectro de fluorescência da mesma solução numa cubeta de 10 mm. Calcular
e anotar a intensidade integrada de fluorescência (área sob a da curva).
3. Foram repetidos os passos anteriores para cinco soluções aumentando a concentração da amostra escolhida, padrão ou composto a estudar.
4. Foi feito o gráfico de intensidade de fluorescência integrada versus absorbância. O resultado deve ser uma linha reta com coeficiente angular m, e intercepto = 0.
Com os valores de coeficiente angular obtidos do gráfico para amostra padrão como para amostra em estudo, os valores absolutos de rendimento quântico são calculados pela seguinte equação:
Φ
x= Φ
pad(m
x/m
pad)(η
2x/ η
2pad)
Onde pad = amostra padrão, x = amostra a estudar e η = índice de refração dos solventes.
Foram preparadas soluções de sulfato de quinina (
Φ
F=0,54), como padrão (10 mg em 10mL de H2SO4), e dos compostos (10 mg em 10 mL de acetonitrila). Tomamos uma alíquota de 1 mL das soluções anteriores e diluímos num balão volumétrico de 5 mL. Os espectros de absorção foram feitos numa cubeta de 5cm de caminho óptico, onde em 15 mL de DMF foram colocadas alíquotas de 50μL das solução de estudo por 5 vezes. Para obter os espectros de fluorescência, 3 mL da solução usada para obter os espectros de absorção, foram passados para uma cubeta de 1cm de caminho óptico.
28