A análise por 16S-TGGE dos produtos PCR realizou-se num equipamento BIOMETRA TGGE Maxi System, segundo as especificações do fornecedor. Os produtos PCR (5 µl) foram aplicados directamente num gel de poliacrilamida a 6% contendo 8 M ureia, 2% de glicerol e 20% de formamida. As corridas foram efectuadas com um sistema tampão TAE 1x. Aplicou-se um gradiente térmico linear de 44ºC a 52ºC, a uma voltagem constante de 120 V, durante 20 horas. Os géis foram corados com nitrato de prata e digitalizados.
As bandas do gel seleccionadas foram excisadas e armazenadas em eppendorfs contendo 50 μl de tampão TE, a 4ºC para posterior análise. As bandas excisadas foram reamplificadas com os “primers” 341F sem “clamp” e 534R (Tabela 2.2), e os produtos PCR foram purificados com o kit Jet Quick (Genomed) para sequenciação posterior.
2.4.4.1. Optimização do gradiente de temperatura e tempo de
corrida
Para determinar a melhor gama de temperatura e o tempo necessário para a corrida de TGGE dos produtos PCR, efectuaram-se vários ensaios, usando o equipamento BIOMETRA TGGE Maxi System:
i) Produtos PCR (5 µl), obtidos da amplificação de fragmentos de DNA extraídos de amostras de efluente de adega de Olhalvo com os “primers” 104F_GC e 534R (Tabela 2.2), foram aplicados directamente num gel de poliacrilamida a 6% contendo 8 M ureia, glicerol a 2% e formamida a 20%. As corridas foram efectuadas com um sistema tampão TAE 1x. Aplicou-se um gradiente de temperatura de 20º a 60ºC, a uma voltagem constante de 350 V, durante 18 horas.
ii) Seleccionou-se um gradiente de temperatura de 37ºC a 51ºC para efectuar a corrida TGGE num gel de poliacrilamida a 6% contendo 8 M ureia, glicerol a 2% e formamida a 20%, a uma voltagem constante de 350 V. Testaram-se quatro tempos de corrida para a electroforese: 12, 14, 16 e 18 horas. Aplicaram-se 5 µl dos produtos PCR, obtidos da amplificação com os “primers” 104F_GC e 534R, de fragmentos de DNA extraídos de amostras de efluente de adega.
iii) Produtos PCR (5 µl), obtidos da amplificação com os “primers” 104F_GC e
534R, de fragmentos de DNA extraídos de amostras de efluente de lagar de azeite de Oliveira do Hospital, foram aplicados directamente num gel de
poliacrilamida a 6% contendo 8 M ureia, glicerol a 2% e formamida a 20%. As corridas foram efectuadas com um sistema tampão TAE 1x. Aplicou-se um gradiente de temperatura de 43 a 49ºC, a uma voltagem constante de 200 V, durante 18 horas.
iv) Seleccionou-se um gradiente de temperatura de 44ºC a 50ºC e optou-se por
diminuir a voltagem para efectuar uma segunda corrida de TGGE. Testaram-se três tempos de corrida para a electroforese, a uma voltagem constante de 150 V: 12, 15 e 18 horas. Aplicaram-se 5 µl dos produtos PCR, obtidos da amplificação com os “primers” 104F_GC e 534R, de fragmentos de DNA extraídos de amostras de efluente de lagar de azeite.
v) Testou-se o gradiente de temperatura de 43ºC a 51ºC para a separação dos produtos PCR, obtidos da amplificação com os “primers” 341F-GC e 534R, de fragmentos de DNA extraídos de amostras provenientes do biotratamento do efluente de lagar de Pernes, a uma voltagem constante de 150 V, durante 16 horas.
vi) Testou-se o gradiente de temperatura de 44ºC a 52ºC para a separação dos
produtos PCR, obtidos da amplificação com os “primers” 341F_GC e 534R, de fragmentos de DNA extraídos de amostras provenientes do biotratamento do efluente de lagar de Pernes, a uma voltagem constante de 120 V, durante 20 horas.
2.4.4.2. Definição de um marcador térmico
Procedeu-se à construção de um marcador sensível ao gradiente térmico que é utilizado durante a corrida de TGGE, amplificando o fragmento resultante da aplicação dos “primers” 341F-GC e 534R (Tabela 2.2) a partir do DNA genómico de 23 estirpes previamente identificadas, pertencentes a grupos bacterianos distintos, descritos na Tabela 2.3. Uma vez que estes fragmentos foram obtidos utilizando um “primer” com “clamp” de GC, o seu comportamento no gel será dependente da sua cinética de desnaturação no gradiente escolhido, permitindo normalizar os géis tendo em conta possíveis desvios de cada temperatura ao longo do gel.
Tabela 2.3 – Estirpes testadas em TGGE para definição do marcador de
temperatura.
Nº Amostra Espécie Estirpe Origem*
1 Pseudomonas sp. SM1408 Ambiental (BioFig-ICAT) 2 Marinobacter sp. MGSC275 Projecto SEAHMA (ICAT) 3 Photobacter sp. Ph01 Ambiental (BioFig-ICAT) 4 Escherichia coli XL1-Blue Stratagene
5 Bacteroides sp LS1401 Ambiental (BioFig-ICAT) 6 Delftia sp. MGSC278 Projecto SEAHMA (ICAT) 7 Acinetobacter sp. CS041 Ambiental (BioFig-ICAT) 8 Bacteroides sp. LS1405 Ambiental (BioFig-ICAT) 9 Bacillus subtilis L16601 BioFig-ICAT 10 Alcaligenes faecalis CECT CECT 449T
11 Campylobacte fetus DSMZ DSM 5361T
12 Azospirillum sp. MGCA283 Projecto SEAHMA (ICAT) 13 Acetobacter aceti CECT CECT 298T
14 Desulfovibrio sp. LSBA135 Projecto SEAHMA (ICAT) 15 Paracoccus denitrificans CECT CECT 674T
16 Staphylococcus sp. CS031 Ambiental (BioFig-ICAT) 17 Streptococcus sp. CS005 Ambiental (BioFig-ICAT) 18 Aerococcus sp. CS052 Ambiental (BioFig-ICAT) 19 Lactobacillus brevis CECT CECT 4390T
20 Exiguobacterium sp. AR1801 Ambiental (BioFig-ICAT) 21 Clostridium sp LS1601 Ambiental (BioFig-ICAT) 22 Micrococcus sp. CS003 Ambiental (BioFig-ICAT) 23 Microbacterium sp. CS043 Ambiental (BioFig-ICAT)
*BioFIG: Center for Biodiversity, Functional, and Integrative Genomics (Portugal); ICAT, Instituto de Ciência Aplicada e Tecnologia; DSM, Deutsch Sammlung von Mikroorganismen (Alemanha); CECT, Colección Española de Cultivos Tipo (Espanha).
Após a amplificação destes fragmentos e a sua visualização em gel de agarose, todos os produtos PCR (5 µl) foram aplicados directamente num gel de TGGE (poliacrilamida a 6% contendo 8 M ureia, glicerol a 2% e formamida a 20%). As corridas foram efectuadas com um sistema tampão TAE 1x. Aplicou-se um gradiente térmico linear de 43ºC a 51ºC, a uma voltagem constante de 150 V, durante 16 horas.
Os fragmentos amplificados por PCR foram quantificados em gel de agarose por densitometria (com recurso ao “KODAK 1D Image Analysis Software”, Rochester, New York, USA).Uma vez definido o marcador, prepararam-se várias diluições (1:1, 1:2, 1:4
e 1:8) do mesmo, a fim de estabelecer a quantidade mínima de DNA necessária em cada banda de modo a permitir a sua detecção no gel de TGGE.
2.4.4.3. Influência da reamplificação dos produtos PCR nos perfis
de TGGE
Determinaram-se os perfis correspondentes a quatro amostras provenientes do biotratamento do efluente de lagar de azeite de Pernes, com e sem reamplificação, a fim de avaliar a influência deste processo na qualidade dos perfis obtidos e na intensidade das bandas visualizadas.
Após a amplificação destes fragmentos com os “primers” 341F-GC e 534R (Tabela 2.2) e a sua visualização em gel de agarose, todos os produtos PCR (5 µl) foram aplicados directamente num gel de TGGE (poliacrilamida a 6% contendo 8 M ureia, glicerol a 2% e formamida a 20%). As corridas foram efectuadas com um sistema tampão TAE 1x. Aplicou-se um gradiente térmico linear de 44ºC a 52ºC, a uma voltagem constante de 120 V, durante 20 horas.