4.6 S AMMENDRAG AV TO ARTIKLER FRA UTVALGET
4.6.2 Theoretical Perspectives for Strategic Human Resource Management (1992)
3.1 Animais
Foram utilizadas ratas da linhagem Wistar pesando entre 180 e 250g, as quais foram mantidas no Biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, recebendo ração (Labina-Purina, São Paulo, Brasil) e água ad libitum, com ciclo de claro/escuro de 12/12h e temperatura de 22 ± 2 ºC. Os animais (n=50) foram divididos em dois Grupos: Controle – GC (n=25), Grupo Ooforectomizado – GO (n=25). Cada Grupo foi subdividido em cinco Sub-Grupos: Sedentário – S (n=5), Sedentário Exercício Agudo – SEA (n=5), Exercitado 30 dias – E30 (n=5), Exercitado 60 dias – E60 (n=5) e Exercitado 90 dias – E90 (n=5). Esse trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (CEP-HUOL) com protocolo 016/07 (Anexo I).
FIGURA 6 – Organograma da distribuição dos Grupos (Controle e Ooforectomizado) e Subgrupos (Sedentário, Sedentário Exercício Agudo, Exercitados 30 dias, Exercitados 60 dias e Exercitados 90 dias).
RATAS WISTAR, n=50
GRUPO
OOFORECTOMIZADO (GO), n=25
Subgrupo Sedentário Exercício Agudo (SEA-C), n=5
Subgrupo Sedentário (NT-C), n=5
Subgrupo Exercitado Regular por 30 dias (E30-C), n=5 Subgrupo Exercitado Regular por 60 dias (E60-C), n=5 Subgrupo Exercitado Regular por 90 dias (E90-C), n=5
Subgrupo Sedentário Exercício Agudo (SEA-O), n=5
Subgrupo Sedentário (S-O), n=5
Subgrupo Exercitado Regular por 30 dia (E30-O), n=5 Subgrupo Exercitado Regular por 60 dias (E60-O), n=5 Subgrupo Exercitado Regular por 90 dias (E90-O), n=5 GRUPO CONTROLE
(GC), n=25
3.2 Protocolos de Exercícios
O modelo de exercício de escolha foi a natação forçada (GOBATTO et al. 2001; GÜNDÜZ et al 2004), baseado na colocação dos animais em recipiente com água (100 x 200 de largura e comprimento e 50 cm de profundidade) e com temperatura e tempo controlados. Inicialmente os animais foram submetidos a 10 minutos de exercício, sendo este tempo acrescido em 10 minutos diariamente até o total de 60 minutos. Nos dias subsequentes, até antevéspera do sacrifício a natação foi mantida por 60 minutos. Em dois momentos antes do sacrifício, na véspera e duas horas antes, os animais dos subgrupos NTEA, E30, E60 e E90 foram submetidos à carga de 90 minutos de exercício (Tabela 1).
Subgrupos Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 a 2 dias antes do sacrifício 01 dia antes do sacrifício 02 horas antes do sacrifício S-C/ S-O Sem Exercício Sem Exercício Sem Exercício Sem Exercício Sem Exercício Sem Exercício Sem Exercício Sem Exercício SEA-C/SEA-O Sem Exercício Sem Exercício Sem Exercício Sem Exercício Sem Exercício Sem
Exercício 90 min. 90 min.
E30-C/ E30-O 10 min. 20 min. 30 min. 40 min. 50 min. 60 min. 90 min. 90 min.
E60-C/ E60-O 10 min. 20 min. 30 min. 40 min. 50 min. 60 min. 90 min. 90 min.
E90-C/ E90-O 10 min. 20 min. 30 min. 40 min. 50 min. 60 min. 90 min. 90 min.
Tabela 1 – Protocolo de exercício atribuído a cada Subgrupo Sedentário Controle (S-C) e Sedentário Ooforectomizado (S-O); Sedentário Exercício Agudo Controle (SEA-C) e Sedentário Exercício Agudo Ooforectomizado (SEA-O); Exercitado 30 dias (E30-C) e Exercitado 30 dias Ooforectomizado (E30- O); Exercitado 60 dias Controle (E60-C) e Exercitado 60 dias Ooforectomizado (E60-O); Exercitado 90 dias Controle (E90-C) e Exercitado 90 dias Ooforectomizado (E90-O).
3.3 Modelo de Hipoestrogenismo
O modelo de escolha para a instalação do quadro de hipoestrogenismo foi a ooforectomia. Todos os animais ficaram alocados em gaiolas próprias para ratos (cinco ratas/gaiola) e receberam água e ração à vontade. Anestesiados com Tiopental (45 mg/kg; i.p.), realizou-se laparotomia mediana de três centímetros de extensão para a retirada dos ovários bilateralmente. O fechamento da parede abdominal foi em dois planos, com pontos simples, utilizando fio de polipropileno
monofilamentar 5-0 para a aponeurose e mononáilon 4-0 para a pele. Esse procedimento cirúrgico foi feito no Departamento de Cirurgia Experimental no Centro de Ciências da Saúde da Universidade federal do Rio Grande do Norte (CCS- UFRN).
3.4 Sacrifício dos Animais
Os animais foram anestesiados com tiopental sódico (Cristália, Brasil) (40 mg/kg de peso via i.p.), sendo em seguida submetidos à laparotomia para coleta de cerca de 5 mL de sangue por punção cardíaca e posteriormente foram retirados o fígado e cérebro para análise.
3.5 Preparo das Amostras
3.5.1 Sangue
Foram coletados 5 mL de sangue em tubo com anticoagulante (Ácido Etilenodiamino Tetra-acético – EDTA 5%, Sigma E5134, PM = 372,24). 1mL da amostra destinou-se a determinação do conteúdo de GSH. O restante (4 mL) foi processado em centrifuga (Sigma Laborzentrifugen 2K15, Alemanha) a 604 x g durante 10 minutos a 4ºC). O plasma obtido foi utilizado para a determinação das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (SRAT) e os eritrócitos foram destinados ao preparo do hemolisado para determinação da atividade enzimática antioxidante.
3.5.2 Preparo do Hemolisado
As hemácias obtidas anteriormente foram lavadas com solução refrigerada
de tampão fosfato (Tampão: KH2PO4 Sigma P0662, PM = 136,09 / K2HPO4 Sigma
P0620, PM = 174,2) 0,05 M pH 7,0 e centrifugadas a 604 x g, durante 10 minutos, a 4ºC (Sigma Laborzentrifugen 2K15, Alemanha), desprezando-se, em seguida, o sobrenadante. Esse procedimento foi repetido três vezes. Alíquotas de 0,1 mL foram
retiradas e hemolisadas com solução de β-mercaptoetanol 0,4 % (v/v) (sigma M6250, PM 78,13) por três ciclos de congelamento e descongelamento com posterior armazenamento a -20 ºC para determinação da GPx, SOD. Sendo a atividade da catalase determinada de imediato.
3.5.3 Homogenato de tecidos
Para o preparo do homogenato, após a remoção cirúrgica, os órgãos foram pesados e, em seguida, homogeneizados (Homogeneizador tipo Potter-Elvehjem)
em solução tampão Fosfato (Tampão: KH2PO4 Sigma P0662, PM = 136,09 /
K2HPO4 Sigma P0620, PM = 174,2) 0,05M pH 7,0, na proporção de 1g do tecido
para 9mL do tampão em temperatura de 4 ºC durante 30 segundos. Os homogenatos foram submetidos à centrifugação de 10.000 x g, 4ºC, por 4 minutos,
(IEC Multi RF – Thermo Electron Corporation®,USA) e as amostras obtidas utilizadas
para determinação dos biomarcadores de estresse oxidativo.
3.6. Determinação das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (SRAT)
A técnica fundamenta-se na determinação colorimétrica de produtos que reagem com o Ácido Tiobarbitúrico (TBA), dentre elas o Malonildialdeido (MDA) produzidos durante a peroxidação lipídica, conforme Figura 7 (YAGI, 1984):
Figura 7. Reação do TBA entre o ácido 2-tiobarbitúrico e o malonildialdeído, formando o composto colorido, medido espectrofotometricamente a 532 nm (OSAWA; FELICIO; GONÇALVES, 2005).
3.6.1 Plasma
A análise foi realizada em duplicata com cada microtubo contendo 300µL plasma e 1,2 mL de solução com Ácido Tricloroacético (TCA, Sigma 116114, PM = 163,39) a 15% e TBA a 0,73%. Cada microtubo foi homogeneizado em vortex
durante 30 segundos, em seguida submetido a um banho de água fervente (100 ͦ C)
por uma hora e posterior banho de gelo por 20 minutos. Em seguida, os microtubos
foram centrifugados (Sigma Laborzentrifugen 2K15, Alemanha) a 16667 x g, a 4 ͦ C,
durante 10 minutos. Posteriormente, foi separado 1 mL do sobrenadante para leitura espectrofotométrica, realizada a 535nm (Shimadzu UV-VISIBLE modelo 1650-PC, Tokyo, Japão).
Para a preparação do branco, foi realizado o mesmo procedimento utilizado para cada amostra, sendo adicionada água no lugar da amostra. A concentração de SRAT foi expressa em µmol/L e calculada a partir da absorbância mensurada em
535 nm, utilizando-se coeficiente de extinção 0,156 µM-1.cm-1.
3.6.2 Tecidos (cérebro e fígado)
A técnica para a determinação das concentrações de SRAT, em tecidos (cérebro e fígado), fundamenta-se na metodologia descrita por Yagi (1984) citada anteriormente. Foram utilizados tubos contendo 1 mL do sobrenadante do homogenato e 1 mL de Ácido Tricloroacético (TCA, Sigma 116114, PM = 163,39) a 15%. Cada tubo foi centrifugado (Sigma Laborzentrifugen 2K15, Alemanha) a 4.167 x g, a 4 °C, durante 4 min., homogeneizado em agitador tipo vortex durante 30 segundos, e, posteriormente, adicionou-se 1 mL de solução com Ácido Tricloroacético (TCA, Sigma 116114, PM = 163,39) a 15% e TBA a 0,73%. Em seguida, cada tubo foi submetido a um banho de água a 100°C durante uma hora, banho de gelo por 20 minutos e centrifugação (Sigma Laborzentrifugen 2K15, Alemanha) a 4.167 x g a 4°C durante 10 min. Logo após, 1 mL do sobrenadante foi separado para a leitura (Shimadzu UV-VISIBLE modelo 1650-PC, Tokyo, Japão).
Para a preparação do branco, foi realizado o mesmo procedimento utilizado para cada amostra, sendo substituída a amostra por água destilada. A concentração
de SRAT foi expressa em µmol/L e calculada a partir da absorbância mensurada em
535 nm, utilizando-se coeficiente de extinção 0,156 µM-1.cm-1.
3.7. Determinação do conteúdo de Glutationa Reduzida (GSH)
A Glutationa foi determinada em sangue total e homogenatos dos tecidos, conforme metodologia descrita por BEUTLER et al. (1963) nos animais do grupo controle e ooforectomizados. O método baseia-se na reação (figura 8) de redução do ácido 5,5'-ditiobis-[2-nitrobenzoico] (DTNB) com a Glutationa (GSH), gerando o ácido tio-2-nitrobenzoico (TNB) de cor amarela e estável sob refrigeração. As leituras foram feitas a 412 nm (Shimadzu UV-VISIBLE modelo 1650-PC, Tokyo, Japão).
Figura 8 - Reação entre GSH e DTNB formando o TNB de coloração amarela.
3.7.1 Sangue Total
Para a determinação da GSH, utilizou-se tubo contendo 0,2 mL de sangue total e 800 µL de Ácido Tricloroacético (TCA, Sigma 116114, PM = 163,39) a 15%. Cada tubo foi centrifugado (Sigma Laborzentrifugen 2K15, Alemanha) a 4.167 x g a 4°C durante 4 minutos, retirando-se, em seguida, 0,2 mL do sobrenadante que foi
adicionado em 2 mL de solução Tampão Fosfato (Tampão: KH2PO4 Sigma P0662,
PM = 136,09 / K2HPO4 Sigma P0620, PM = 174,2) 0,2M pH 8,0. Dessa mistura
transferiu-se 2 mL para cubeta e adicionou-se 0,2 mL de DTNB (ácido 5,5´-
ditiobisnitorbenzóico, sigma D8130, PM = 396,3) para posterior leitura. O branco foi preparado sem o sangue ou homogenato, centrifugado (Shimadzu UV-VISIBLE modelo 1650-PC, Tokyo, Japão) e submetido às mesmas condições da amostra para posterior leitura (Shimadzu UV-VISIBLE modelo 1650-PC, Tokyo, Japão). A concentração de GSH foi expressa em mmol/L e calculada a partir da absorbância
mensurada em 412 nm, utilizando-se coeficiente de extinção 14,1 µM-1.cm-1.
3.7.2 Tecidos (cérebro e fígado)
Para a determinação da GSH em tecidos (cérebro e fígado), utilizou-se tubo contendo 1 mL do sobrenadante de homogenato e 1 mL de Ácido Tricloroacético (TCA, Sigma 116114, PM = 163,39) a 15%. Cada tubo foi centrifugado a 4167 x g a 4°C durante 4 minutos, retirando-se, em seguida, 0,2 mL do sobrenadante que foi
adicionado em 2 mL de solução Tampão Fosfato (Tampão: KH2PO4 Sigma P0662,
PM = 136,09 / K2HPO4 Sigma P0620, PM = 174,2) 0,2M pH 8,0. Dessa mistura,
transferiu-se 2 mL para cubeta e adicionou-se 0,2 mL de DTNB para posterior leitura. O branco foi preparado sem o sangue ou homogenato, centrifugado (Sigma Laborzentrifugen 2K15, Alemanha) e submetido às mesmas condições da amostra para posterior leitura (Shimadzu UV-VISIBLE modelo 1650-PC, Tokyo, Japão). A concentração de GSH foi expressa em mmol/L e calculada a partir da absorbância
mensurada em 412 nm, utilizando-se coeficiente de extinção 14,1 µM-1.cm-1.
3.8 Determinação da atividade da Glutationa Peroxidase (E.C. 1.6.4.2)
A atividade da Glutationa Peroxidase (GPx) foi determinada pela técnica descrita por SIES em 1979. O método baseia-se na medida do decréscimo de absorbância promovido durante a oxidação do NADPH (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato reduzida, Sigma N1630, pureza 97%, PM = 833,4), medido a
340 nm, conforme mostrado na Figura 9 (ε = 6,22 mM-1. cm-1) (Shimadzu UV-
VISIBLE modelo 1650-PC, Tokyo, Japão).
Figura 9 – Reação utilizada para determinação da atividade da GPx que tem por base a medida do decréscimo de absorbância por oxidação do NADPH.
3.8.1 Intra-eritrocitária
Para a avaliação da atividade da enzima GPx, foi adicionado a cubeta 1 mL
do meio de reação, pipetado 10 μL do hemolisado (diluído 1/10 em solução do β-
mercaptoetanol) e 10 μL de solução de peróxido de t-butila (Sigma B2633, t-BuOOH,
PM = 90,12), posteriormente a leitura que foi feita por 5 minutos a 340nm e temperatura de 30 °C. O branco foi obtido de forma semelhante, porém sem a
adição de 10 μL da amostra.
3.8.2 Tecido (cérebro e fígado)
Para a avaliação da atividade da enzima GPx nos tecidos, foi adicionado à
cubeta 1 mL do meio de reação, pipetado 10 μL do homogenato diluído 1/50 em
tampão (Tampão: KH2PO4 Sigma P0662, PM = 136,09 / K2HPO4 Sigma P0620, PM
= 174,2) 0,05M pH 7,0 e 10 μL de solução de peróxido de t-butila (Sigma B2633, t-
BuOOH, PM = 90,12), posteriormente a leitura que foi feita por 5 minutos a 340nm e temperatura de 30 °C. O branco foi obtido de forma semelhante, porém sem a
adição de 10 μL da amostra.
3.9 Determinação da atividade da Superóxido Dismutase (SOD) (E.C. 1.15.1.1)
A enzima superóxido dismutase (SOD) promove a captura do íon superóxido
e inibe a formação do Fe2+ pelo citocromo C (Sigma C7752, PM 12.384); o pico de
absorbância do complexo citocromo C – Fe2+ pode ser determinado a 550 nm, (ε =
21,0 x 103 M-1 cm-1), conforme Figura 10 (Shimadzu UV-VISIBLE modelo 1650-PC,
Tokyo, Japão) (McCORD, J.M.; FRIDOVICH, I., 1969).
Figura 10 – Reação utilizada para determinação da atividade da SOD que compete com o Citocromo
C+++ pelo Ânion Superóxido (McCORD; FRIDOVICH, 1969).
3.9.1 Intra-eritrocitária e tecidos (cérebro e fígado)
Para a determinação da atividade da SOD intra-eritrocitária, foi centrifugado (Sigma Laborzentrifugen 2K15, Alemanha) o hemolisado e homogenato a 4167 x g a 4°C durante 5 minutos, para posterior leitura. Inicialmente o zero de absorbância foi ajustado com água destilada e, em seguida, feita a leitura do meio de reação Xantina (Sigma X2502, PM 174,1)/Citocromo C (Sigma C7752, PM 12.384). O branco desta reação tem que ser determinado antes da corrida da amostra através de ensaios em que 1 ml do meio de reação adicionou-se quantidades crescentes de
xantina oxidase diluída, entre 20 a 40µL. O branco adotado foi aquele cujo delta de
absorbância apresentou-se entre 0,015 e 0,020. Após essa determinação foi feita a
leitura da amostra, adicionando na cubeta 1 ml de meio de reação, 20 a 40µL
xantina oxidase (Sigma X1875, EC 232.657.6) e 20µL da amostra (tabela 3).
3.10 Determinação da atividade da Catalase (CAT) (E.C. 1.11.1.6)
A catalase promove a decomposição de peróxido de hidrogênio a oxigênio e água (Figura 11). A técnica empregada foi descrita por BEUTLER, em 1984, que quantifica a velocidade de decomposição do peróxido pela enzima, através do
decréscimo da absorbância a 230 nm (ε = 0,071 mM-1.cm-1) (Shimadzu UV-VISIBLE
modelo 1650-PC, Tokyo, Japão).
Figura 11 – Ação da Catalase na eliminação do Peróxido de Hidrogênio (H2O2)
3.10.1 Intra-eritrocitária
Para avaliar a atividade da catalase foi utilizado 20 µL do hemolisado, o qual foi acrescentado na cubeta de leitura, junto a 980 µL de um meio de reação contendo Tris 1M (Tris Hidroxi-metil Aminometano, PM = 121,14) / EDTA (Etilenodiamino Tetracético, Sigma E5134, PM = 372,24) (5 mM, pH 8,0), e peróxido
de hidrogênio a 50% (H2O2 10 mM), conforme tabela 4. Para a preparação do
branco, foi feito um pool do sobrenadante das amostras, do qual se retirou 20 µL que foi colocado na cubeta de leitura, em um meio de reação contendo apenas Tris 1M (Tris Hidroxi-metil Aminometano, PM = 121,14)/ EDTA (Etilenodiamino Tetracético, Sigma E5134, PM = 372,24) (5 mM, pH 8,0). A atividade da catalase eritrocitária foi expressa, respectivamente em U/mg de Hb.
3.10.2 Tecidos (cérebro e fígado)
Para avaliar a atividade da catalase no fígado, inicialmente homogenato foi diluído
em solução Tampão Fosfato (Tampão: KH2PO4 Sigma P0662, PM = 136,09 / K2HPO4
Sigma P0620, PM = 174,2) 0,05 M pH 7,0 (1/100). Quanto ao homogenato de cérebro,
não houve diluição. Em seguida, 20 µL dessas amostras foram acrescentado na cubeta de
leitura, junto a 980 µL de um meio de reação, contendo Tris 1M (Tris Hidroxi-metil
Aminometano, PM = 121,14)/ EDTA (Etilenodiamino Tetracético, Sigma E5134, PM
= 372,24) (5 mM, pH 8,0), e peróxido de hidrogênio a 50% (H2O2 10 mM). Para a
preparação do branco foi feito um pool do sobrenadante das amostras, do qual se retirou 20
µL que foi colocado na cubeta de leitura, em um meio de reação contendo apenas Tris 1M
(Tris Hidroxi-metil Aminometano, PM = 121,14)/ EDTA (Etilenodiamino Tetracético,
Sigma E5134, PM = 372,24) (5 mM, pH 8,0). A atividade da catalase nos tecidos foram
expressas em U/mg de proteína.
3.11 Análise Estatística
O tratamento estatístico foi feito através da Análise de Variância (ANOVA) para amostras paramétricas e independentes, seguidas do teste de Tukey para comparação de grupos independentes. Estes testes foram realizados através do programa GraphPad InStat (Versão 3.05, 2000).
4 RESULTADOS
4.1 Avaliação da Peroxidação Lipídica
A peroxidação lipídica representa um importante mecanismo de dano celular via ataque de ERO e os subprodutos formados são Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (SRAT). Analiticamente a quantificação das concentrações de SRAT representa um importante marcador de dano oxidativo (THEROND, 2000).
A figura 12 mostra as concentrações de SRAT em plasma nos grupos controle e ooforectomizados. Os animais submetidos ao exercício físico sem prévia adaptação (SEA-C e SEA-O) apresentaram dano oxidativo superior aos seus respectivos subgrupos, sedentários e exercitados; sendo este dano mais intenso nos animais ooforectomizados (SEA-O). Os animais do grupo controle exercitados
regularmente, frente aos animais sedentários (E30-C, E60-C e E90-C vs. S),
apresentaram concentrações de SRAT inferiores nos primeiros dois meses, em seguida alcançaram valores compatíveis no período de 90 dias. Já nos animais ooforectomizados, dos subgrupos E30-O e E60-O ainda se mostravam com valores superiores ao subgrupo sedentário, este compatível somente com E90-O.
Figura 12 – Efeito do exercício físico na concentração de SRAT no plasma dos grupos Controle (GC) e ooforectomizados (GO). Diferenças significativas: * p<0,05 vs. S, # p<0,05 vs. SEA, ○ p<0,05 vs. E30, ● p<0,05 vs. E60 e a p<0,05 vs. o respectivo do GC. Os resultados foram submetidos à ANOVA
seguido do Teste de Tukey-Kramer para comparar grupos independentes.
GC
GO
0 25 50 75 100*
*
*
*
# # # ° • a a a a # # # Legenda Sedentário - SSedentário exercício agudo - SEA Exercitados 30 dias - E30 Exercitados 60 dias - E60 Exercitados 90 dias - E90
S R AT ( µ m o l/ L) 23 | P á g i n a
Assim como no plasma, o fígado apresentou elevação significativa da peroxidação lipídica nos subgrupos SEA-C e SEA-O representados na figura 13. Os animais controle exercitados regularmente (E30-C, E60-C e E90-C) apresentaram diminuição da peroxidação lipídica quando comparados ao subgrupo SEA-C e semelhantes ao subgrupo S-C. Contudo, nos animais ooforectomizados a diminuição ocorreu de forma significativa apenas no E90-0 quando comparado a S- O. Além disso, todos os animais ooforectomizados exercitados regularmente (E30-0, E60-O e E90-O) apresentaram peroxidação lipídica significativamente maior que os respectivos do grupo controle.
Figura 13 – Efeito do exercício físico na concentração de SRAT em fígado nos Grupos Controle (GC) e Ooforectomizados (GO). Diferenças significativas: * p<0,05 vs. S, # p<0,05 vs. SEA, ○ p<0,05 vs. E30 e a p<0,05 vs. o respectivo do GC. Os resultados foram submetidos à ANOVA seguido do Teste
de Tukey-Kramer para comparar grupos independentes.
GC GO 0 20 40 60 80 100
*
# # #*
*
# # #° a a a a*
Legenda Sedentário - SSedentário exercício agudo - SEA Exercitados 30 dias - E30 Exercitados 60 dias - E60 Exercitados 90 dias - E90
S R AT (µ m o l/ L) 24 | P á g i n a
Quanto ao perfil de lipoperoxidação no cérebro (figura 14), o grupo controle não apresentou variação entre seus subgrupos. Porém, os animais ooforectomizados e exercitados sem prévia adaptação (SEA-O) apresentaram concentração de SRAT superiores a todos os demais grupos, ooforectomizados ou controle.
Figura 14 – Efeito do exercício físico na concentração de SRAT em cérebro nos Grupos Controle (GC) e Ooforectomizados (GO). Diferenças significativas: * p<0,05 vs. S, # p<0,05 vs. SEA e a p<0,05
vs. o respectivo do GC. Os resultados foram submetidos à ANOVA seguido do Teste de Tukey- Kramer para comparar grupos independentes.
GC GO 0 20 40 60 80 100
*
# # # a Legenda Sedentário - SSedentário exercício agudo - SEA Exercitados 30 dias - E30 Exercitados 60 dias - E60 Exercitados 90 dias - E90
S R AT (µ m o l/ L) 25 | P á g i n a
4.2 Biomarcadores antioxidantes
4.2.1. Glutationa Reduzida (GSH)
A Glutationa Reduzida (GSH) é um tripeptídeo (L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina)
implicado em inúmeras funções biológicas, destacando-se sua ação antioxidante. O
GSH é co-fator da Glutationa Peroxidase (GPx), funcionando como doador de H+
para estabilização de ERO e sendo oxidada no processo (GSSG). Sua depleção em sistemas biológicos associa-se à elevação de agentes oxidantes no meio (THEROND, 2000).
O conteúdo sérico de GSH nos subgrupos SEA-C e SEA-O se apresentaram diminuídos quando comparados aos subgrupos S-C e S-O (figura 15), respectivamente. No grupo controle, a atividade física regular (E30-C, E60-C e E90- C) provocou inicialmente queda no conteúdo de GSH, só retornando aos valores semelhantes ao subgrupo S-C com 90 dias de exercício regular. Os animais ooforectomizados e exercitados regularmente (E30-O, E60-O e E90-O) em comparação ao subgrupo SEA-O, não apresentaram decréscimo no conteúdo sanguíneo de GSH no decorrer do protocolo experimental.
Figura 15 – Efeito do exercício físico no conteúdo de GSH no sangue total nos grupos controle (GC) e ooforectomizados (GO). Diferenças significativas: * p<0,05 vs. S, # p<0,05 vs. SEA, ○ p<0,05 vs. E30,
● p<0,05 vs. E60 e a p<0,05 vs. o respectivo do GC. Os resultados foram submetidos à ANOVA
seguido do Teste de Tukey-Kramer para comparar grupos independentes.
GC GO 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 # a a
* * *
° •*
# # # Legenda Sedentário - SSedentário exercício agudo - SEA Exercitados 30 dias - E30 Exercitados 60 dias - E60 Exercitados 90 dias - E90
G S H ( m m o l/L ) 26 | P á g i n a
Assim como o resultado observado no conteúdo plasmático de GSH (figura 15), o exercício físico intenso sem prévia adaptação provocou em diminuição no conteúdo de GSH hepático em ambos os subgrupos (SEA-C e SEA-O) (figura 16). No entanto, o grupo controle apresentou melhora significativa com treinamento regular (E30-C, E60-C e E90-C), mas não chegando a superar os valores do subgrupo sedentário. Os valores de GSH nos subgrupos ooforectomizados foram menores do que seus respectivos do grupo controle, exceto o subgrupo SEA-O. Como também, a manutenção do conteúdo hepático de GSH pelo exercício físico, este benefício só se mostrou evidente a partir de 60 dias de protocolo (E60-O e E90- O).
Figura 16 – Efeito do exercício físico no conteúdo de GSH em fígado nos Grupos Controle (GC) e Ooforectomizados (GO). Diferenças significativas: * p<0,05 vs. S, # p<0,05 vs. SEA, e a p<0,05 vs. o
respectivo do GC. Os resultados foram submetidos à ANOVA seguido do Teste de Tukey-Kramer para comparar grupos independentes.
GC GO 0 2 4 6 8 10
*
*
# # # # # a a a a Legenda Sedentário - SSedentário exercício agudo - SEA Exercitados 30 dias - E30
Exercitados 60 dias - E60 Exercitados 90 dias - E90
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Quanto ao conteúdo de GSH no cérebro (figura 17) dos animais controle, a atividade física provocou sua elevação tanto nos animais sedentários exercitados agudamente (SEA-C) quanto nos exercitados regularmente por pelo menos 60 dias (E30-C e E60-C). Somente após 90 dias de atividade física (E90-C) houve regressão do conteúdo de GSH, ficando semelhantes ao subgrupo S-C. Os animais ooforectomizados não apresentaram diferenças significativas entre seus subgrupos, entretanto os animais dos subgrupos SEA-O, E30-O e E60-O apresentaram diminuição significativa quando comparados aos respectivos grupos controle.
Figura 17 – Efeito do exercício físico no conteúdo de GSH em cérebro nos Grupos Controle (GC) e Ooforectomizados (GO). Diferenças significativas: * p<0,05 vs. S, # p<0,05 vs. SEA, ○ p<0,05 vs. E30
e a p<0,05 vs. o respectivo do GC. Os resultados foram submetidos à ANOVA seguido do Teste de
Tukey-Kramer para comparar grupos independentes.
GC GO 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 #° #°
*
*
*
a a a Legenda Sedentário - SSedentário exercicio agudo - SEA Exercitados 30 dias - E30 Exercitados 60 dias - E60 Exercitados 90 dias - E90
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4.2.2 Glutationa Peroxidase (GPx)
A Glutationa Peroxidase (GPx) é uma enzima com função de prevenir o
organismo da exposição a estresse oxidativo, pois remove H2O2, formando H2O e
utilizando como co-fator a Glutationa Reduzida (GSH), que é convertida em Glutationa Oxidada (GSSG). A elevação da atividade dessa enzima está relacionada ao aumento do consumo de GSH e a demanda ao sistema antioxidante para
detoxificar ERO, em especial o H2O2.
A figura 18 mostra os resultados referentes à atividade da enzima GPx que na maioria das observações se encontra inversamente proporcional ao conteúdo de GSH em sangue total. Os animais controle apresentaram elevação da GPx em E30- C e E60-C, caracterizando uma elevação da atividade enzimática, e no subgrupo E90-C um retorno a atividade semelhante ao subgrupo S-C. O grupo ooforectomizado não apresenta diferença significativa entre os subgrupos, entretanto a atividade dessa enzima se encontra bastante prejudicada pelo hipoestrogenismo evidenciado pela diminuição significativa de todos os subgrupos (S-O, SEA-O, E30-O, E60-O e E90-O) quando comparado aos respectivos controles.
Figura 18 – Efeito do exercício físico na atividade da GPx em hemolisado nos Grupos Controle (GC) e Ooforectomizados (GO). Diferenças significativas: * p<0,05 vs. S, # p<0,05 vs. SEA, ○ p<0,05 vs. E30
e a p<0,05 vs. o respectivo do GC. Os resultados foram submetidos à ANOVA seguido do Teste de