The SL Approach Framework

O gene estrutural que codifica a H+_{-ATPase da membrana plasmática (PMA1) em S. cerevisiae}

é essencial à viabilidade celular, sendo considerado um dos mais proeminentes genes housekeeping nesta levedura (Serrano et al., 1986). A manipulação genética da expressão de PMA1 demonstrou que a H+-ATPase da membrana plasmática regula a taxa de crescimento celular, e que mutações que anulem a expressão do gene são letais para a célula (Serrano et al., 1986; Ghislain et al., 1987). A sua expressão parece estar controlada por uma proteína activadora do promotor, o factor TUF (Capieux et al., 1989).

Um segundo gene estrutural, o PMA2, codificante da mesma proteína, foi identificado em S. cerevisae (Schlesser et al., 1988) e em Sch. pombe (Ghislain & Goffeau, 1991). O PMA2 apresenta uma elevada homologia com o PMA1, de cerca de 90% de identidade ao nível da proteína (Schlesser et al., 1988). Todavia, estas duas isoformas exibem diferentes características cinéticas e de regulação, sugerindo diferentes funções. Os genes PMA1 e PMA2 são funcionalmente intercambiáveis (Supply et al., 1993), muito embora o gene PMA2 seja expresso muito fracamente e considerado não essencial (Schlesser et al., 1988; Ghislain & Goffeau, 1991; Fernandes & Sá-Correia, 1999). Apesar da inactivação do gene PMA2 não modificar a cinética de crescimento celular, pelo menos em condições normais de pH (Goffeau et al., 1990; Ghislain & Goffeau, 1991), mutantes pma2 de S. cerevisiae revelaram-se mais sensíveis a meios de crescimento ácidos e menos sensíveis a condições alcalinas, em consonância com o facto do gene PMA2 codificar uma proteína com actividade de H+_-ATPase

(Goffeau et al., 1990).

A expressão dos genes PMA1 e PMA2 foi avaliada durante o crescimento em meio com glucose e concentrações crescentes de etanol usando fusões PMA1-lacZ e PMA2-lacZ e análise por Northern blot com RNA total e uma sonda para o gene PMA1 (Monteiro et al., 1994). Verificou-se que a presença de concentrações sub-letais de etanol (6% v/v) aumentou a expressão de PMA2, enquanto que a expressão de PMA1 foi reduzida. Observou-se também que, apesar de existir uma aparente correspondência entre a activação da ATPase da membrana plasmática e o aumento da expressão de PMA2, o nível máximo de expressão de PMA2 permaneceu, aproximadamente, 200 vezes mais baixo do que o nível de PMA1. Por outro lado, o etanol activou a H+_{-ATPase da membrana plasmática de uma estirpe que}

expressava apenas a Pma1p, não activando a da estirpe que apenas expressava a Pma2p. Os mesmos autores demonstraram ainda que, na presença de etanol, é a Pma1p que é activada, provavelmente por um mecanismo pós-tradução que não parece afectar a Pma2p.

O domínio regulador envolvido na activação da H+_{-ATPase da membrana plasmática induzida}

pela acidificação do meio exterior ou pela presença de glucose parece ser o terminal carboxilo da ATPase, o qual, independentemente do mecanismo envolvido, aparece como o único domínio da ATPase responsável pela modulação da actividade da enzima (Portillo et al., 1989; 1991; Benito et al., 1992; Eraso & Portillo, 1994; Monteiro & Sá-Correia, 1998). Foram identificados alguns aminoácidos (por ex., S911A e T912A) que, quando alterados, são capazes de suprimir os efeitos das mutações originais e tornam a ATPase inactivável pela glucose (Portillo et al., 1991; Eraso & Portillo, 1994).

O gene PMA1 já foi sequenciado em inúmeras espécies de leveduras e de fungos filamentosos. Foi verificada uma elevada homologia entre si (com excepção das sequências terminais amino e carboxilo) e com as sequências dos genes das ATPases que transportam diferentes catiões (mono- e divalentes) da membrana plasmática de leveduras. A homologia também é elevada com as ATPases de células animais e vegetais.

A análise e comparação dos genomas de diferentes espécies - genómica comparativa - tem contribuído de forma acentuada tanto para o conhecimento e melhor compreensão de como as espécies evoluem como para a determinação da função e estrutura de genes e de regiões não codificantes do genoma. A genómica comparativa poderá também contribuir para melhor entender até que ponto as variações em certos aminoácidos em proteínas homólogas poderão ser responsáveis pelas diferenças nas características e respostas a estímulos. O poder desta abordagem complementa a análise experimental e é elevada em termos de sensibilidade e precisão (Kellis et al., 2003). O genoma completo de S. cerevisae está disponível desde 1996 (Goffeau et al., 1996) e, desde então, tem sido um instrumento poderoso para a aquisição de informação biológica e uma base de comparação de sequências de genomas de inúmeros organismos próximos (outras leveduras e fungos filamentosos) entretanto conhecidas.

4.1.4. Estudos descritos neste capítulo

A necessidade de manutenção do pH intracelular entre valores metabolicamente aceitáveis durante a fermentação alcoólica e o conhecimento de que o etanol provoca um aumento do influxo passivo de protões através da membrana plasmática conduziram à hipótese de que uma maior capacidade fermentativa se poderia relacionar com uma ATPase mais eficiente. Esta hipótese foi, aparentemente, contrariada pelos resultados descritos no capítulo anterior, que mostram que leveduras com maior capacidade fermentativa (S. cerevisiae e S. bayanus) apresentam actividades ATPásicas mais baixas do que leveduras que produzem menos etanol (por ex., P. mexicana). Sabendo que o etanol estimula a actividade da H+_{-ATPase da}

membrana plasmática em S. cerevisiae e P. stipitis, decidiu-se averiguar se esta resposta seria generalizada e se haveria uma relação com a capacidade de produção de etanol pelas diferentes leveduras. Para tentar responder a esta questão, estudou-se o efeito do etanol na actividade da H+_{-ATPase da membrana plasmática de leveduras não-Saccharomyces, em}

comparação com as de S. cerevisiae e de P. stipitis, espécies já estudadas por outros autores. Como primeiro passo, foram determinados os valores de pH óptimos para as ATPases das diferentes leveduras analisadas.

Adicionalmente, procedeu-se a uma análise comparativa das sequências da Pma1p das leveduras investigadas neste trabalho. Esta comparação, para além de permitir uma apreciação preliminar sobre regiões variáveis e o estabelecimento de possíveis correlações com características bioquímicas diferenciais das várias ATPases estudadas, visou avaliar se o gene PMA1 será útil para inferir sobre relações filogenéticas em leveduras.

4.2. Materiais e métodos

4.2.1. Leveduras

Três das leveduras isoladas, e que apresentaram diferentes actividades ATPásicas, foram seleccionadas para estudar a influência do pH e efeito do etanol na actividade da ATPase da membrana plasmática (ver Capítulo 3): C. quercitrusa PYCC 5789, H. uvarum PYCC 5782 e P. mexicana PYCC 5790. Nos ensaios para a determinação do pH óptimo foram também utilizadas, para comparação, P. stipitis PYCC 4374T_{, S. bayanus PYCC 4890 e S. cerevisiae}

PYCC 4072. Para o mesmo efeito, nos estudos com etanol foram também ensaiadas P. stipitis PYCC 4374T_{, S. cerevisiae PYCC 5632 e S. cerevisiae PYCC 3507-III. A amplificação e}

sequenciação dum fragmento de PMA1 incidiram em seis das leveduras isoladas: C. pseudointermedia PYCC 5788, C. quercitrusa PYCC 5789, Candida sp. nov. PYCC 5791, H. uvarum PYCC 5782, P. guilliermondii PYCC 5784 e P. mexicana PYCC 5790. Também se utilizou a estirpe-tipo de S. cerevisiae (PYCC 4455T_{) como controlo.}

4.2.2. Meios e condições de cultura

Nos ensaios para a determinação de pH óptimo foram utilizadas as condições descritas por Serrano (1978; 1983; 1984). Os inóculos foram preparados, partindo de culturas frescas em meio sólido, em balões Erlenmeyer (250 ml) com 100 ml de meio líquido YNB (Difco) contendo 0,5% p/v extracto de levedura, 0,5% p/v (NH4)2SO4 e 10% p/v glucose, com pH ajustado a 5,4,

incubados durante a noite a 30 ºC (150 rpm). Para as experiências, foram inoculados balões Erlenmeyer (500 ml) com 300 ml do mesmo meio líquido, mas com 3% p/v glucose, de modo a que a A640nm inicial fosse cerca de 0,35, mantendo as restantes condições de crescimento.

Para a determinação do efeito do etanol na actividade ATPásica, procedeu-se de modo semelhante mas adicionando aos meios de cultura (pré-inóculo e inóculo) concentrações diferentes de etanol, conforme indicado, e incubando a 16 ºC (150 rpm) até se obter uma A640nm

entre 0,35-0,40. As concentrações de etanol que permitiram crescimento variaram com a espécie: até 5% v/v para C. quercitrusa PYCC 5789; até 4% v/v para H. uvarum PYCC 5782; até 6% v/v para P. mexicana PYCC 5790; até 2% v/v para P. stipitis PYCC 4374T_{; e até 10%}

v/v para S. cerevisiae PYCC 3507-III. Como controlo, foram sempre realizadas culturas na ausência de etanol.