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As interacções entre a via de sinalização das TGF-β e a via das ERK iniciam-se na membrana citoplasmática. As ERK são activadas por MEKs, por sua vez activadas por Raf anteriormente fosforilado por Ras. Ras é libertado para o citoplasma como resultado de uma cadeia de fosforilações que ocorre a partir dos RTKs integrados na membrana (Zhang 2009).

Grande parte da indução da fosforilação de ERK parece ocorrer nas RTKs, e os receptores de Tipo I do TGF-β interagem com as RTKs para despoletar a via das MEK/ERKs que resulta na fosforilação das ERKs. Os receptores de Tipo II também parecem interagir com a via de sinalização das MEKs/ERKs (Schlessinger 2000; Lee et al. 2007; Zhang 2009).

Apesar de se conhecer como as duas vias interagem a nível da membrana citoplasmática a partir dos receptores de Tipo I e Tipo II, o papel da endoglina sobre a activação da ERK induzida por TGF-β é praticamente desconhecido. O nosso grupo demonstrou que a activação da ERK induzida por TGF-β em mioblastos que expressam L- endoglina é menor do que nas células Mock (Rodriguez-Barbero et al. 2006). No entanto, não se sabe nada sobre o efeito da exposição de S-endoglina.

Mediante estudo da expressão e fosforilação de ERK, os efeitos da endoglina sobre a fosforilação da ERK manifestam-se imediatamente. As duas isoformas parecem ter efeitos opostos, em relação aos mioblastos Mock. A L-endoglina reduz a fosforilação de ERK, enquanto a S-endoglina aumenta-a. Estas diferenças observam-se mesmo na ausência

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de TGF-β: este facto sugere que a endoglina possui interacções com a via das ERKs independente de activação por TGF-β (Fig. 40 e 41).

Quando sujeitas a tratamento por TGF-β (25 mM) durante 30 minutos, observa-se um aumento da fosforilação de ERK nas três estirpes celulares. Não se observam grandes diferenças na fosforilação de ERK induzida por TGF-β entre células que expressam as isoformas L e S de endoglina, o que sugere que apesar das diferenças em termos de efeito basal, ambas formas possuem o mesmo efeito na regulação da activação da ERK induzida por TGF-β (Fig. 41).

Existe uma grande diferença entre a activação de ERK nas células que expressam as isoformas L- e S-endoglina. Esta, é muito superior nas células que expressam S-endoglina e muito mais baixa nas células que expressam L-endoglina que nos mioblastos Mock. Devido às limitações da técnica de Western Blot, para obtermos algo comparável e válido temos de realizar todos os experimentos na mesma membrana e com recurso às mesmas condições de revelação. Após repetidos testes, a exposição mínima que permite a detecção de fosforilação nos mioblastos L-endoglina ultrapassa o ponto de saturação da S-endoglina. Na Fig. 42, a diferença entre a activação em mioblastos L-endoglina e S-endoglina, devido aos limites de detecção do método, parece menor do que na realidade. O aumento real da activação da ERK nos mioblastos que expressam S-endoglina é muito superior ao apresentado graficamente Convém realçar que o Western Blot é uma técnica qualitativa, embora possa ser considerada semi-quantitativa por alguns autores. Embora esta técnica permita detectar as proteínas, quantificá-las de forma precisa ultrapassa os limites de sensibilidade da técnica.

Não foram observadas diferenças na expressão de ERK nos mioblastos Mock, L- e S-endoglina tratados ou não com TGF-β (Fig. 40 e 42).

Foi utilizada a tubulina como controlo de carga, demonstrando que todos os poços foram carregados com a mesma quantidade de proteínas (Fig. 40 e 43).

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Fig. 40. Efeito do tratamento com TGF-β sobre a expressão e fosforilação de ERK em mioblastos Mock, L-endoglina e S-endoglina. Os mioblastos foram deprivados de soro durante 24 horas, sendo

tratados com 25 mM de TGF-β durante 30 minutos e posteriormente lisados. A detecção das proteínas ERK e pERK foram feitas por Western Blot. Devido à forte detecção de fosfo-ERK das células S-endoglina, revelou-se com menos tempo de exposição (A) de modo a observar qualquer diferença entre a activação basal e induzida por tratamento com TGF-β. C = Controlo, T = TGF-β.

Fig. 41. Representação gráfica do efeito do tratamento com TGF-β sobre a fosforilação de ERK. Os

mioblastos foram deprivados de soro durante 24 horas, sendo tratados com 25 mM de TGF-β durante 30 minutos e posteriormente lisados. A determinação de pERK foi feita por Western Blot. Representação em gráfico de barras corresponde à semiquantificação através de Scion Image de fosfo-ERK. Os resultados estão expressos em percentagem em relação à quantidade presente nos mioblastos Mock em estado basal. Os dados, obtidos a partir de três experimentos diferentes, são bastante semelhantes. No entanto, aqui só se encontra representado um resultado. C = Controlo, T = TGF-β.

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Fig. 42. Representação gráfica do efeito do tratamento com TGF-β sobre a expressão ERK. Os

mioblastos foram deprivados de soro durante 24 horas, sendo tratados com 25 mM de TGF-β durante 30 minutos e posteriormente lisados. A determinação de ERK foi feita por Western Blot. Representação em gráfico de barras corresponde à semiquantificação através de Scion Image de ERK. Os resultados estão expressos em percentagem em relação à quantidade presente nos mioblastos Mock em estado basal. Os dados, obtidos a partir de três experimentos diferentes, são bastante semelhantes. No entanto, aqui só se encontra representado um resultado. C = Controlo, T = TGF-β.

Fig. 43. Controlo de carga de ERK e fosfo-ERK com tubulina. A determinação de tubulina foi feita por

Western Blot e recurso a anticorpo anti-tubulina de ratinho. Representação em gráfico de barras corresponde à semiquantificação através de Scion Image de tubulina. Os resultados estão expressos em percentagem em relação à quantidade presente nos mioblastos Mock em estado basal. Os dados, obtidos a partir de três experimentos diferentes, são bastante semelhantes. No entanto, aqui só se encontra representado um resultado. C = Controlo, T = TGF-β.

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