2 Metode
2.7 Testing for totale koliforme bakterier og E.coli
As amost ras f oram submet idas à elet rof orese em gel de agarose, mét odo desenvolvido por Jaques e col. (1968) e modif icado por Diet rich & Diet rich (1976). Alíquot as de 5µl de cada amost ra f oram aplicadas em lâminas de gel de agarose 0,6% (Bio Rad Laborat ories Inc., Hercules, CA, EUA), com uma espessura de 0,2cm, preparado em t ampão PDA (1,3 diaminopropano acet at o 0,05M, pH 9.0) sobre uma lâmina de vidro. A elet rof orese f oi realizada em caixa ref rigerada a 4ºC (5-8V/ cm durant e aproximadament e 40min.). Est e t ampão discrimina os compost os de acordo com int eração com a diamina. Os GAGs migram para o pólo posit ivo, pois possuem carga negat iva devido aos grupament os sulf at o e carboxila. Pela ordem decrescent e de mobilidade elet rof orét ica t emos: o
Material e Métodos
condroit im 4- e 6-sulf at os, dermat am sulf at o, heparam sulf at o e heparina.Decorrido o t empo necessário para a adequada migração elet rof orét ica, os glicosaminoglicanos f oram precipit ados no gel pelo det ergent e bromet o de cet il t rimet ilamônio 0,1% CETAVLON® (Merck, Darmst adt , Alemanha) por, no mínimo, 2h. A seguir, o gel f oi seco sob calor e vent ilação, e corado com uma solução de azul de t oluidina 0,1% (Fisher Scient if ic Co., Fair Lawn, NY, EUA) em ácido acét ico 1% e et anol 50% por 15min., o excesso de corant e f oi removido por uma solução de ácido acét ico 1% em et anol 50%, a seguir os géis f oram secos à t emperat ura ambient e. Depois de secos os géis f oram expost os a um f ilme radiosensivel Mul t ipurpose (Packard Inst rument s Co.) por 24h e submet idos à varredura em um sist ema de análise de imagem.
4. 5. 4. Cromatografia em papel
Após precipit ação com et anol, como descrit o no it em 4.5.2., os GAGs receberam ácido t ricloroacét ico TCA 90%, numa concent ração f inal de 10%, por 15min. a 4° C. As amost ras f oram cent rif ugadas a 12.000xg e o sobrenadant e, cont endo os GAGs, neut ralizado com NaOH. Novament e os GAGs f oram precipit ados com 3 volumes de met anol e mant idos a -20ºC por 24h. Após cent rif ugação a 5.000xg por 30min., o precipit ado, f oi ressuspenso com água dest ilada.
A cromat ograf ia em papel f oi ut ilizada para separação dos produt os f ormados por ação das enzimas específ icas. Os subst rat os f oram incubados com as enzimas heparit inase I e II, para análise do heparam sulf at o e condroit inase AC ou ABC, para análise do condroit im sulf at o, por 24h. Após a incubação, os produt os f ormados f oram aplicados em papel What man n° 1 e submet idos à cromat ograf ia descendent e em papel, por 18h, em ácido isobut írico: NH4OH 1,25 M (5:3 - v/ v).
A seguir, os cromat ogramas com as amost ras marcadas com [35S]-sulf at o f oram secos a t emperat ura ambient e e os cromat ogramas com os padrões com aqueciment o (80°C). Os produt os dos padrões f oram det ect ados por absorção em
U.V., revelados com nit rat o de prat a em meio alcalino e f ixados com t iossulf at o de sódio a 5%.
Os cromat ogramas com mat erial marcado com [35S]-sulf at o f oram impressionados e quant if icados em sist ema de análise de imagem, Cyclone® (St orage Phosphor Syst em – Packard Inst r.), “ scanner” de radioat ividade, que realizou a leit ura de um f ilme ao qual as amost ras f oram expost as por 48h. A quant if icação dos compost os marcados com o radioisót opo f oi realizada com o “ sof t ware” Opt i Quant i®.
4. 5. 5. Quantificação dos GAGs marcado metabolicamente
Os GAGs marcados com [35S]-sulf at o de sódio f oram ident if icados em sist ema de análise de imagem, Cyclone® (St orage Phosphor Syst em – Packard Inst r.), “ scanner” de radioat ividade, que realiza a leit ura de um f ilme ao qual os géis f icam expost os por t empos variáveis, dependendo dos níveis de radioat ividade das amost ras. Com o “ sof t ware” Opt i Quant i®, a quant if icação dos compost os marcados com o radioisót opo f oi realizada.
Alt ernat ivament e após a elet rof orese em gel de agarose em t ampão PDA, as lâminas de agarose após t erem sido expost as ao f ilme radiosensível t iveram suas bandas, cont endo os compost os marcados com [35S]-sulf at o, recort adas do gel e a radioat ividade f oi det erminada em um cont ador de cint ilações ut ilizando como líquido de cint ilação Ult ima Gold (Packard Inst rument s Company Inc.Downers Grove, IL, EUA). A quant idade t ot al de cpm de cada amost ra f oi calculada com base nos valores obt idos para a alíquot a submet ida à elet rof orese. A concent ração de prot eína de cada amost ra f oi det erminada em uma alíquot a do ext rat o celular ut ilizando-se o mét odo de dosagem por Coomassie Blue segundo descrit o por Spect or (Spect or, 1978).
4. 6. Imunocitoquímica
As células f oram cult ivadas sobre lamínula circular de 12mm de diâmet ro (3 lamínulas por poço) em uma concent ração de 4.105 células/ poço e 2.105 no insert o Transwell®. Foram mant idas em placas Transwell de 6 poços a 37ºC sob
Material e Métodos
t ensão de 5% de CO2, por 4 dias. Os cont roles f oram cult ivados sob as mesmascondições, porém sem o insert o Transwell.
4. 6. 1. Marcação externa – Versicam
Após esse período de cult ivo, o meio f oi removido e as células lavadas 5 vezes em meio DMEM na ausência de SFB. A seguir, as células f oram incubadas com ant icorpo primário, em PBS cont endo 5% de SFB por 1h a 4ºC. Ao f inal da incubação, as células f oram lavadas por cinco vezes em PBS 0,1 M e ent ão f ixadas em f ormaldeído 2% em PBS por 30 min. à t emperat ura ambient e. Após a f ixação, as células f oram lavadas 2 vezes em PBS 0,1, e uma vez em PBS cont endo 0,1M de glicina (para bloquear os radicais aldeídicos) e 2 vezes em PBS (ant icorpos primários e secundários ut ilizados est ão descrit os em mat eriais).