A SOD corresponde a uma família de enzimas com diferentes grupos prostéticos em sua composição. Nos sistemas eucariontes, existem duas formas de SOD. A forma SOD-cobre-zinco (Cu-Zn SOD) está presente principalmente no citosol e nos fluidos extracelulares, enquanto que a SOD-manganês (Mn SOD) está localizada primariamente nas mitocôndrias (TARHAN & TUZMEN, 2000; SCANDALIOS, 2005). Esta enzima tem papel antioxidante importante, já que catalisa a dismutação do radical O2-• em H2O2 e O2 (Quadro 3). A taxa de dismutação da SOD é aproximadamente 104 vezes maior do que a dismutação química (FRIDOVICH, 1975). A sua atividade é limitada pelo H2O2, produto de sua ação, uma vez que longos períodos de exposição ou altas concentrações de peróxido de hidrogênio podem ocasionar alterações cúpricas (Cu2+) e cuprosas (Cu1+) em sua estrutura, levando a uma inativação irreversível (TARHAN & TÜZMEN, 2000).
Quadro 3: Desintoxicação do ânion superóxido (O•-), produzido durante o metabolismo celular, pela enzima superóxido dismutase (SOD).
A SOD, juntamente com a catalase e a glutationa peroxidase, constituem uma das principais defesas antioxidantes que atuam nos organismos superiores (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989). É possível, ainda, que a SOD contribua com efeitos de anti- envelhecimento reais, podendo atuar positivamente sobre todos os processos degenerativos (BECKMAN & AMES, 1998).
A SOD desempenha papel fundamental na defesa do organismo contra as ERO por atuar na remoção do radical superóxido (McCORD & FRIDOVICH, 1969). Antes da sua descoberta, a SOD já havia sido descrita como uma proteína que contém cobre, mas nenhuma atividade catalítica lhe havia sido atribuída. Após o trabalho de McCORD & FRIDOVICH (1969), com a determinação de sua função na dismutação do radical superóxido (O2•-), seu papel foi estabelecido e, até hoje, apesar de inúmeras pesquisas realizadas com esta enzima, nenhum outro substrato foi descrito, mostrando a sua especificidade para o ânion superóxido (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989).
2O
2•-+ 2H
+H
2O
2+ O
2 SOD2O
2•-+ 2H
+H
2O
2+ O
2 SODA forma Cu-Zn SOD (PM = 32-kDa) é muito estável e parece estar presente em praticamente todas as células eucarióticas (plantas ou animais), sendo constituída de duas subunidades protéicas idênticas, com um átomo de cobre e um de zinco em cada uma delas. O Zn, ao contrário do Cu, não funciona como sítio catalítico, mas aparece para estabilizar a enzima. Esta conclusão foi extraída de experiências nas quais os metais foram removidos dos sítios ativos e recolocados em outros, sozinhos ou em conjunto (McCORD & FRIDOVICH, 1969; FRIDOVICH, 1974, 1975, 1995; BABIOR, 1997).
A Mn SOD (PM = 40-kDa), uma proteína que contém manganês nos sítios ativos, tem sua atividade diminuída em pH alcalino mas não é inibida pelo cianeto nem pelo di-etil- di-hidrocarbonato. Porém, é destruída em presença de clorofórmio + etanol, o que implica que os métodos típicos de purificação para a Cu-Zn SOD não podem ser empregados. A atividade da Mn SOD em relação a Cu-Zn SOD depende do tecido e das espécies onde atuam. A remoção do Mn dos sítios ativos causa perda da atividade catalítica, não podendo ser reposto por nenhum íon de transição perdendo, assim, a sua atividade funcional (FRIDOVICH, 1974, 1975, 1995; BABIOR, 1997).
A Cu-Zn SOD é a principal enzima envolvida na remoção dos ânions superóxido do citoplasma e do peroxissoma (GRALLA & KOSMAN, 1992; JAMIESON et al., 1994), enquanto que a função fisiológica da Mn SOD parece ser responsável em proteger a mitocôndria dos superóxidos gerados durante a respiração celular (COSTA et al., 1997; GUIDOT et al., 1993; JAMIESON et al., 1994). Porém, também existem evidências funcionais de que a Cu-Zn SOD desempenhe importante função protetora contra ânions superóxidos derivados da respiração celular (AYUB et al., 1992). Por exemplo, as células mutantes, nulas de SOD1 (Cu-Zn SOD), deixam de crescer em meios contendo lactato como única fonte de carbono, um fenótipo típico de células respiratórias deficientes (GRALLA & KOSMAN, 1992). Atualmente, é evidente que a Cu-Zn SOD pode ter função no tamponamento da concentração de cobre intracelular. Entretanto, esta função não aparece relatada como um mecanismo de proteção contra o estresse oxidante (CULOTTA et al., 1995).
As seqüências de aminoácidos da Mn SOD são parecidas em todas as espécies e não estão relacionadas com aquelas da Cu-Zn SOD. A forma Cu-Zn SOD apresenta-se mais resistente às variações de temperatura e à desnaturação por substâncias como cloreto de guanidina, duodecil sulfato de sódio ou uréia e, em organismos superiores, é responsável por cerca de 90% da atividade total da SOD presente nas células (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989).
Finalmente, há mais uma forma de SOD distinta das outras já descritas. Esta enzima possui peso molecular de 135-kDa, é um tetrâmero que contém Cu e Zn e possui um peptídeo sinalizador que direciona esta enzima exclusivamente para o espaço extracelular. Por estar presente principalmente em fluidos extracelulares como o plasma, foi denominada SOD extracelular. Sua atividade é pouco expressiva em comparação com as outras formas de superóxido dismutase (MARKLUND, 1982). O papel que a SOD extracelular desempenha, nos diferentes estados fisiológicos, está apenas começando a ser esclarecido (ZELKO et al., 2002).
Existem diferentes tipos de SOD, dependendo do metal que atua como co-fator em seu sítio catalítico, mas todas elas agem basicamente de acordo com a mesma reação descrita anteriormente (Quadro 3).
Entre as diversas espécies de peixes já estudadas, esta enzima demonstrou uma alta similaridade em suas propriedades funcionais e estruturais, inclusive em peixes antárticos com sangue destituído de hemoglobinas (BANNISTER et al., 1977; VIG et al., 1989; NATOLI et al., 1990).
1.4.1.2 Catalase (CAT – E.C. 1.11.1.16)
A catalase (PM = 240-kDa) é uma hemeproteína citoplasmática que catalisa a redução do H2O2 em H2O e O2 (Quadro 4) e, por isso, é considerada um dos maiores componentes da defesa antioxidante primária (GAETANI et al., 1989). A catalase possui um
alto Km para o H2O2, decompondo-o a uma taxa extremamente rápida de cerca de 107 mol.L-1.seg-1 (SCANDALIOS, 2005).
Por apresentar um elevado Km, a CAT dificilmente é saturada pelo H2O2 e a saturação pelo substrato ocorre na faixa de 5 mol.L-1 de H2O2. Por outro lado, há uma rápida inativação da CAT em concentrações de aproximadamente de 0,1 mol.L-1, quando o complexo ativo enzima-H2O2 (complexo I) é convertido a complexos inativos (complexos II e III) (AEBI, 1984). Portanto, medidas da atividade enzimática por saturação de substrato são impossíveis.
A atividade catalítica desta enzima pode ser inibida por ânion superóxido, azida sódica, cianeto de hidrogênio (HCN), não sendo, entretanto, inibida por outros íons cianetos (CN-) (CHANCE, 1952b; KONO & FRIDOVICH, 1982).
Quadro 4: Desintoxicação do peróxido de hidrogênio (H2O2), produzido durante o metabolismo celular, pela enzima catalase (CAT).
A CAT está localizada principalmente nos peroxissomos da maioria das células aeróbicas e, em animais, se encontra principalmente no fígado, rins e eritrócitos. Órgãos como cérebro, coração e músculo esquelético contém pequenas quantidades da enzima (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989). Entretanto, a atividade desta enzima não tem sido constatada nos eritrócitos de diversas espécies de peixes (RABIE et al., 1972; SMITH, 1976; WILHELM-FILHO et al., 1993; WILHELM-FILHO & MARCON, 1996).
A catalase apresenta quatro subunidades, cada uma contendo um grupamento Fe3+-protoporfirina ligado ao seu sítio ativo (WIEACKER et al., 1980). Com relação ao pH, pode-se observar uma diminuição da atividade da enzima em valores abaixo de 4,0 e acima de 8,5, sendo que na faixa de pH de 4,0 a 8,5, a atividade da catalase permanece constante e ideal (CHANCE et al., 1952a).
Além de seu papel como espécie reativa de oxigênio e, portanto, causador de estresse oxidante, o H2O2 em excesso causa oxidação da hemoglobina e, conseqüentemente, diminuição das concentrações de oxigênio, o que pode acarretar infecções, formação de úlceras e até necrose (WIEACKER et al., 1980). Desta forma, é imprescindível o trabalho da CAT.
A suplementação de catalase exógena previne a oxidação da glutationa reduzida mediada pelo H2O2 em eritrócitos humanos normais (SCOTT et al., 1991) e inibe as lesões oxidativas do DNA de timo de carneiros submetidos à sobrecarga de Fe3+ (ARUOMA et al., 1989). Em modelo de estresse oxidante decorrente de agressão térmica, os eritrócitos exibem diminuição da atividade da CAT durante o processo hemolítico termodependente (HATHERILL et al., 1991).
Segundo SCANDALIOS (2005), a redução do H2O2 em H2O e O2 pela CAT requer a presença de altas concentrações de H2O2 (Quadro 4). Desta forma, a CAT atuaria como um suporte para o sistema glutationa dependente (discutido em 1.4.1.3), o qual também apresenta como uma de suas funções a desintoxicação do H2O2 quando este se encontra em baixas concentrações. Assim, na presença de baixos níveis de H2O2, os peróxidos seriam eliminados preferencialmente pela glutationa peroxidase (GPx) enquanto que, em altas concentrações de H2O2, predominaria a ação da CAT.
H
2O
2+ H
2O
22H
2O + O
2 CATH
2O
2+ H
2O
22H
2O + O
2 CATEm baixas concentrações de H2O2, a CAT atuaria oxidando uma variedade de doadores de hidrogênio como etanol, metanol, ácido ascórbico, fenóis, ácidos fórmicos, com o consumo de 1 mol de peróxido e a uma velocidade muito menor de cerca de 102 a 103 mol.L-1.seg-1 (AEBI, 1984).
Ambos os sistemas parecem ter vantagens e desvantagens para o organismo. A GPx é mais eficiente (tem maior afinidade pelo substrato), é multifuncional (reduz H2O2 livre e também outros peróxidos), é lenta (limitada pela reciclagem do GSH) e metabolicamente dispendiosa, enquanto que a CAT possui baixa afinidade pelo substrato, mas é extremamente rápida (EATON, 1991). Assim, a CAT deve proteger as células de grandes quantidades de H2O2 enquanto que os baixos níveis endógenos devem ficar por conta da GPx, juntamente com o sistema enzimático dependente de GSH (EATON, 1991).
Entretanto, a CAT apresenta sítios de ligação ao NADPH e, quando estes sítios estão ocupados, a CAT opera catalisando a degradação do H2O2 a concentrações semelhantes àquelas em que o sistema glutationa dependente opera (GAETANI et al., 1996). É, portanto, provável que metade do H2O2 produzido na célula é destruído pela CAT (BABIOR, 1997). A ligação do NADPH à enzima poderia ser um mecanismo para proteger a CAT contra a inativação pelo H2O2 ou como fonte de NADPH para a GPx durante o estresse oxidante (KIRKMAN & GAETANI, 1984; KIRKMAN et al., 1999).