Os resultados que descrevemos nas secções anteriores indicam que S. faecium, quando suspenso em tampões Tris-HCl ou fosfato de sódio e potássio (0,05 M, pH 8,0) contendo lisozima capta uma quantidade significativa desta enzima. No intuito de verificar a hipótese de essa ligação ser responsável pela ausência da bacteriólise observada nas condições estudadas apesar da completa degradação da parede celular (Figs. 55e e 61c), decidimos realizar as experiências que se seguem.
Suspensões de células (7,2 x IO8 células/ml) de S. faecium da fase exponencial não congeladas ou congeladas, quando expostas à acção da lisozima na concentração final de 0,01 - 0,4 m g / m l , originaram diferentes taxas de lise que dependeram do tampão utilizado na preparação dessas suspensões. Assim, a Fig. 66 mostra que, quando as células foram suspensas no tampão fosfato de sódio e potássio 0,1M, a taxa de lise observada aumentou à medida que foram utilizadas concentrações mais elevadas de lisozima. Deste modo, a bacteriólise mais extensa ocorreu na con- centração de 0,4 m g / m l , isto é, quando cerca de 0,56 pg de enzima estavam disponíveis por célula bacteriana. Pelo contrário, quando se utilizou o tampão fos- fato de sódio e potássio 0,05 M, foi obtida uma bacteriólise máxima para a concen- tração de 0,05 m g / m l de lisozima, o que corresponde a 0,07 pg de enzima/célula bacteriana.
A Fig. 67 mostra que as cinéticas máximas de lise de células não congeladas ou congeladas, nas duas situações acima referidas, são idênticas.
O estudo ultrastrutural de amostras obtidas após 15 ou 30 min de incubação em tampão fosfato 0,1 M na presença de lisozima (0,4 mg/ml) mostrou (Figs. 68a e 68b) que a degradação da parede celular neste tampão é mais lenta do que a observada em tampões fosfato ou Tris-HCl 0,05 M (comparar Figs. 68a com 55c e 61a; Figs. 68b com 61b). Além disso, a Fig. 68a mostra ainda que quantidades significativas de lisozima se encontravam livres no tampão de incubação, isto é, não ligadas às bactérias, aparecendo como blocos de material precipitado pelo fixador aldeído (ver
também Fig. 55b). Contudo, após duas horas de incubação (Fig. 68c), as células encontravam-se extensamente degradadas - os restos celulares eram constituídos por membranas com perfil simétrico, fibrilas de DNA, protoplastos Usados e outros componentes não identificáveis.A concentração elevada e relativamente constante (entre 60 a 80 %) das proteínas contidas nos filtrados das suspensões celulares (não mostrado) foi apoiada pela análise electroforética das proteínas contidas nos filtrados dessas suspensões (Fig. 69) e revelou que a ligação da lisozima às bactérias era significativamente menor quando a incubação se efectua em tampão fosfato 0,1 M do que nos tampões anteriormente referidos (Figs. 64a - 64c).
A ocorrência de extensa bacteriólise de S. faecium mencionada anteriormente e avaliada por espectrofotometria após duas horas de incubação em tampão fosfato 0,05 M (pH 8,0) contendo 0,05 mg/ml de lisozima foi confirmada pela observação ultrastrutural (Fig. 70) - apenas eram visíveis membranas com perfil simétrico, fibrilas de DNA e constituintes celulares não identificáveis.
Realizámos também experiências com células da fase exponencial suspensas em tampões Tris-HCl (pH 8,0) cujos resultados de espectrofotometria se encontram na Fig. 71; células expostas à acção da lisozima (0,4 mg/ml) em tampão Tris-HCl 0,1M não Usaram, tendo-se verificado um aumento da absorvância inicial (Fig. 71) com um máximo registado após 15 min de incubação. Os resultados ultrastruturais de amostras obtidas ao longo da incubação (Figs. 72a e 72b) foram concordantes com os dados espectrofotométricos porque, não obstante a completa degradação da parede celular, na matriz citoplasmática estiveram sempre presentes ao longo da incubação quantidades significativas de materiais electronodensos. Além disso, a análise electroforética das proteínas contidas nos filtrados de suspensões celulares mostrou que a Ugação da Usozima às células bacterianas ocorreu rapidamente (Fig. 73).
Contudo, uma extensa bacteriólise foi observada em Tris-HCl (0,05 M ou 0,1 M), quando se utilizou lisozima na concentração final de 0,05 m g / m l {Fig. 71). Estes dados espectrofotométricos foram também apoiados pelos resultados ultrastruturais que revelaram uma rápida e extensa degradação das bactérias
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(Figs. 74a e 74b). O congelamento prévio das células em tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 8,0) não aumentou a bacteriólise observada na presença da lisozima (0,05 mg/ml), dado que os valores de absorvância obtidos com células não congeladas ou previamente congeladas ao longo da incubação foram idênticos (Fig. 71).
Experiências paralelas realizadas com células não congeladas ou previamente congeladas expostas à acção da lisozima em tampão fosfato de sódio e potássio 0,1 M (pH 7,0), revelaram resultados idênticos aos obtidos a pH 8,0. Assim, após 120 min de incubação a 37 °C as suspensões celulares (7, 2 x 10 8 células/ml) em tampão fosfato de sódio e potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo lisozima (0,2 ou 0,4 mg/ml) apresenta- ram respectivamente, descidas de 93 e 95% do valor inicial da A520 para as células não congeladas, e de 94 e 95% para as células congeladas - comparar estes valores com os obtidos nestas condições a pH 8,0 (Fig. 66).
o M 1 1 - H •— * -
CXOI Q.OB O.I Q 2 Q.3 O / *
C o n c e n t r a ç ã o c i e i l i s o / i m a ( m g / m l )
Fig. 66. Efeito da concentração da lisozima e do tampão na lise de S. faecium . Células não congeladas ( — ) ou congeladas (—) foram suspensas (7,2 x 10°células/ml) em ( # ) tampão fosfato de sódio e potássio 0,05 M (pH 8,0) ou em ( O ) 0,1 M (pH 8,0) na presença de diferentes concentrações de lisozima (0,01 - 0,4 mg/ml). As células foram colhidas na fase exponencial de crescimento. Os resultados representam os valores obtidos aos 120 min de incubação.
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I 1 1 1 —{— O 3 0 s o g o 1 2 0
T e m p o ( m i n )
Fig. 67 Cinéticas da lise de S. faecium em diferentes condições. Células não congeladas (—) ou congeladas (—) foram suspensas (7,2 x
I O8 células/ml) e incubadas em t a m p ã o fosfato de sódio e
potássio 0,1 M (pH 8,0) na presença de 0,4 m g / m l de lisozima ( O ) ou em 0,05 M (pH 8,0) na presença de 0,05 m g / m l de lisozima ( Jfc ). As células da fase exponencial de crescimento foram congeladas antes da incubação no tampão indicado.
tampão indicado. Notar em (a) a presença da lisozima livre ou ligada às bactérias (setas); comparar com Fig. 55b. Notar em (c) a presença de vesículas da membrana citoplasmática (MC), protoplastos lisados (P) com membrana simétrica e fibrilas de ácido desoxirribonucleico. PC - parede celular, (a) 40 000X; (b) 27 600 X; (c) 60 000 X.
concentradas (ver Materiais e Métodos).
Fig. 70. Restos celulares de S. faecium após 120 min de incubação em tampão fosfato de sódio e potássio 0,05 M (pH 8,0) com 0,05 mg/ml de lisozima. As células da fase exponencial de crescimento foram congeladas antes da incubação no tampão indicado. MC - membrana citoplasmática com perfil simétrico. 25 000 X.
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Fig. 71. Cinéticas da lise de S. faecium em tampões Tris-HCL na presença de lisozima. Suspensões de células (7,2 x 10° células/ml) não congeladas (—)
ou congeladas (—) foram incubadas durante 120 min a 37 °C/ em tampão
Tris-HCÍ 0,1 M (pH 8,0) na presença de 0,4 mg/ml ( • ) ou 0,05 mg/ml (A ) de lisozima ou em tampão Tris-HCÍ 0,05 M (pH 8,0) na presença de 0,05 mg/ml de lisozima ( ▼ ). As células da fase exponencial de crescimento foram congeladas antes da incubação no tampão indicado.
Fig. 72. Ultrastrutura de células de S. faecium expostas à acção da lisozima (0,4 mg/ml) em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0). (a) Células após 60 min ou (b) 120 min de incubação a 37 °C. As células da fase exponencial de crescimento foram congeladas antes da incubação no tampão indicado. Notar em (a) e (b) a presença de material electronodenso e a manutenção da forma da bactéria, não obstante a perda total da parede celular (PC). MC - membrana citoplasmática. (a) 45 000 X; (b) 67 500 X.
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* 11.
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90 60 15 Lis
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Fig. 73. SDS-PAGE de proteínas contidas nos filtrados das suspensões de S.faeciun expostas à lisozima (0,4 mg/ml) em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0). A Í amostras de lisozima e dos filtrados das suspensões celulares, colhidas aos tempos indicados, foram previamente concentradas (para detalhes vei Materiais e Métodos).
Notar a extensa lise observada. PC - parede celular; MC - membrana citoplasmática com perfil simétrico (a) 51 200 X; (b) 33 600 X.
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