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A análise da sequência permite a detecção de outro tipo de polimorfismo não baseado no número de vezes que uma determinada sequência é repetida, mas nas variações ou trocas de nucleótidos que a própria sequência apresenta.

A. HLA DQA1

A análise da região DQa do sistema HLA é um exemplo de polimorfismo, cujo estudo é baseado na variação da sequência. Os genes que codificam para os antigénios do sistema HLA classe II (HLA-D) estão localizados no braço curto do cromossoma 6, organizados em três regiões: HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ. Este sistema codifica para um conjunto de proteínas integrais de membrana, altamente polimórficas, que estão ligadas a fragmentos antigénicos peptídicos.

Devido ao facto deste locus possuir um grau de polimorfismo elevado, é um sistema importante na identificação genética dos indivíduos. Apesar da tipagem tradicional do sistema HLA ser levada a cabo mediante o uso de soros (HLA I), ou culturas mistas de linfócitos (HLA II), com a técnica de PCR foi possível estudar os diferentes alelos do gene HLA DQa (Saiki e col., 1986; Higuchi e Blake, 1989).

O estudo do locus HLA DQA1 consiste na amplificação de fragmentos de 239 pb (alelos 2 e 4) e fragmentos de 242 pb (alelos 1 e 3) e na subtipagem do alelo 1 (1.1, 1.2, 1.3). É também possível subtipar outros alelos, utilizando enzimas de restrição, como, por exemplo, o alelo 4, usando as enzimas de restrição Fok I e Rsa I (Jung e col., 1991) ou o AmpliType PM+DQA1 da Perkin Elmer (N808-0094).

A detecção dos alelos faz-se por hibridação do DNA amplificado, usando "primers" biotinilizados, em tiras que contêm as ASO "probes"(Allelic Specific Oligonucleotide) complementares às sequências do DNA em estudo. A detecção é efectuada por um processo colorimétrico que visualiza a presença da hibridação específica mediante conversão enzimática de um substracto incolor solúvel num precipitado azul, usando a peroxidase-estreptavidina. Aquela detecção é conhecida pelo nome de "dot-blot reverse".

B. Polymarker (PM)

O "Amplitype PM" (Perkin-Elmer) (Saiki e col., 1989) permite a amplificação simultânea de 5 loci genéticos: LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), GYPA (Glycophorin A), HBGG (Hemoglobin G Gammaglobin), D7S8 e Gc (Group Specific Component), sendo os alelos facilmente identificados.

A técnica usada para o estudo destes loci é similar à anteriormente descrita para o HLA DQA1. Quando há complementaridade entre as "probes" e a sequência de DNA em estudo, os alelos são identificados por método colorimétrico que originam o aparecimento de "dots" coradas de azul.

1.3.4. DNA Mitocondrial

A sequenciação do DNA mitocondrial (mtDNA) é um procedimento útil na identificação genética humana. As mitocôndrias são formações citoplasmáticas autorreplicantes que contêm genes extranucleares. Cada célula humana contém 5.000-10.000 mitocôndrias, cada uma das quais possui até 10 moléculas de DNA de dupla cadeia de 16.569 pb, que codificam para dois RNA ribossómicos, 22 RNA de transporte e 13 proteínas, todos relacionados com a cadeia respiratória e fosforilação oxidativa.

A sequência completa do mtDNA foi integralmente estudada por Anderson e col. em 1981, tendo cada nucleótido sido identificado numericamente. As duas cadeias que a constituem foram chamadas H (heavy) e L (light), sendo a cadeia H rica em guaninas e timinas. Actualmente, existe um

consenso geral de empregar a sequência de Anderson (cadeia L) como termo de comparação relativamente às sequências em estudo (Anderson e col., 1981).

Os genomas mitocondriais são idênticos em quase toda a sua extensão para todos os indivíduos da mesma espécie. Contudo, a região D-loop, com um tamanho aproximadamente de 1.000 pb, é uma zona não codificante que possui um elevado polimorfismo, sendo, por isso, de interesse na identificação genética humana (Aquadro e Greenberg, 1983; Cann e col.,

1987).

A sequenciação do mtDNA da região D-loop de vários indivíduos revelou que a probabilidade de dois indivíduos não aparentados serem geneticamente idênticos, para aquela região, é de 0.27% (Orrego e King,

1990).

O mtDNA é de herança materna (herança uniparental citoplasmática materna), pelo que o seu estudo não tem interesse na investigação biológica da paternidade. Todavia, possui especial relevância na identificação individual, uma vez que, todos os indivíduos aparentados pela linha materna possuem sequências de mtDNA idênticas (Hutchison e col., 1974; Giles e col., 1980). Assim, podem ser identificados restos cadavéricos, comparando a sua sequência de mtDNA, com a sequência do mtDNA de indivíduos aparentados, pela linha materna, com o falecido (King, 1991; Holland e col., 1993; Gill e col., 1994).

A análise da região D-loop do mtDNA em amostras para exame medico- legal é um procedimento alternativo ao estudo dos polimorfismos do DNA nuclear, uma vez que, existe um elevado número de cópias de mtDNA em cada célula, o que permite supor que algumas dessas cópias se tenham mantido intactas ao longo do tempo, permanecendo disponíveis mesmo em vestígios com uma certa antiguidade.

Têm sido usadas várias metodologias para o estudo da variabilidade genética mitocondrial. A mais utilizada consiste no estudo por PCR, de duas regiões hipervariáveis amplificadas em separado, tendo na totalidade cerca de 800 nucleótidos, seguido da sequenciação dos produtos amplificados, usando, preferencialmente, a sequenciação cíclica directa, em sequenciadores automáticos.

Evoluções relativamente recentes na tecnologia fluorescente demonstraram que é possível a análise da sequência, usando métodos não radiactivos e automatizados, proporcinando a diminuição dos erros obtidos aquando do

manuseamento dos dados, uma vez que se dispõe de "software" adequado para a identificação dos alelos. Por outro lado, o maior rendimento, em termos de tempo, permite efectuar um maior número de análises de sequenciação (Hopgood, 1992).

Há vários casos internacionalmente famosos em que foi usada a metodologia anteriormente referida, isto é, a amplificação, sequenciação e comparação do DNA obtido a partir de restos cadavéricos antigos, com indivíduos aparentados pela linha materna com os falecidos. De entre esses casos podemos citar, a identificação dos restos cadavéricos de alguns membros da família do último Czar da Rússia, Nicolau II, assassinados pelos bolcheviques, em 1918, e cujos restos foram encontrados em Ekaterimburgo, em 1991. A referida identificação foi levada a cabo por Peter Gill e col.(1994). Outro caso não menos conhecido consistiu na identificação dos restos cadavéricos que se suspeitava pertencerem a Josef Mengele, "O Anjo da Morte", do campo de concentração de Auschwitz, falecido no Brasil. Este estudo foi efectuado por Jeffreys e col.(1992).