Para a extracção de DNA das amostras de baço, fígado, pele, gânglio, medula óssea, sangue, da camada de células mononucleadas, conjuntiva e das formas promastigotas do parasita foi utilizado um método rápido comercial (PCR Template Peparation Kit, Roche Diagnostics GmbH), de acordo com as instruções do
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fabricante. Após a extracção, a concentração de DNA das amostras foi determinada por espectrofotometria (Gene Quant II).
As amostras foram conservadas a –80 ºC até posterior utilização nos métodos de PCR e qRT-PCR.
Amostras de baço, de fígado e pele
Os fragmentos de baço, de fígado e de pele (50 mg) foram macerados juntamente com 200 l de tampão de lise (4 M ureia, 200 mM NaCl, 200 mM EDTA, pH 7.4) e 40 l de proteinase K (20 mg/ml). Depois de uma incubação em banho Maria a +56 ºC durante 1 hora, adicionou-se, por amostra, 200 l de tampão de ligação [6 M guanidina-HCl, 20 % Triton X-100 (v/v), pH 4.4] e voltou-se a incubar a +70 ºC durante 10 minutos. O tampão de ligação contém guanidina-HCL, um sal que promove a lise celular e a inactivação de todas as nucleases presentes na reacção; a proteinase K promove a lise celular e a inactivação de DNAses endógenas. De seguida adicionaram-se 100 l de isopropanol (Sigma) por amostra, para precipitar o DNA. A amostra foi então transferida para as colunas de extracção, onde fica selectivamente retido o DNA após centrifugação durante 1 minuto a 8000 g. Seguiram-se uma lavagem com 500 l de tampão de remoção de inibidores e duas lavagens com tampão de lavagem. Após as lavagens, fez-se uma centrifugação a 13000 g durante 30 segundos, para a remoção de possíveis vestígios de tampão de lavagem. Por fim, o DNA foi eluído em 200 l de tampão de eluição (10 mM Tris, pH 8.5), previamente aquecido a +70 ºC.
Amostras de medula óssea e sangue periférico
A extracção de DNA das células da medula óssea e do sangue foi realizada utilizando 4 discos do papel de filtro de 4 mm de diâmetro cada, os quais foram a
incubar em 200 µl de tampão de lise e com 40 µl de proteinase K durante 1 hora no
banho-Maria a +56 ºC. A extracção de DNA foi processada de acordo com o referido no ponto 2.1.10.1.
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Amostras da camada de células mononucleadas, gânglio linfático e conjuntiva A extracção de DNA das células do “buffy coat”, do aspirado de gânglio e da conjuntiva, foi executada de modo semelhante ao referido no ponto 2.1.10.1., mas
sem a incubação com tampão de lise. Assim, a 200 µl da suspensão celular
adicionaram-se 200 µl de tampão de ligação e 40 µl de proteinase K. Após incubação
a +72 ºC durante 10 minutos adicionou-se 100 µl de isopropanol, homogeneizou-se e
transferiu-se a amostra para a coluna de extracção. Centrifugou-se de seguida a 12000
g durante 1 minuto. A partir deste passo o procedimento foi igual ao referido para a
extracção de DNA descrita anteriormente com a excepção do DNA ter sido eluído em apenas 100 l de tampão.
Todas as amostras foram conservadas a –20 ºC até à sua utilização. Curvas-padrão
A técnica molecular utilizada para a determinação do número de parasitas presentes nas amostras requer a elaboração de uma curva-padrão, obtida a partir de diluições sucessivas de uma suspensão com um número conhecido de parasitas. Para este objectivo foi utilizada uma cultura de massa de promastigotas de L. infantum. A concentração de parasitas na cultura foi determinada pelo valor médio de 10 contagens realizadas em hemacitómetro ao microscópio óptico. As culturas foram
então diluídas de 1:10, entre 1 e 1x106 parasitas, para o qRT-PCR. De seguida
procedeu-se à extracção do DNA dos parasitas de cada uma das diluições, utilizando o método referido no ponto anterior (2.1.10.1.).
O DNA de cada diluição foi dividido em alíquotas e conservado a –20 ºC até posterior utilização.
2.1.10.2. Oligonucleótidos
Todas as sequências iniciadoras e sondas específicas utilizadas neste estudo são as descritas por Rolão et al. (2004a). As sequências foram desenhadas a partir de uma sequência de DNA cinetoplastideal presente nos minicírculos de uma estirpe de
L. infantum (Genebank A/N AF169140). A sequência do minicírculo apresenta cerca
97 2.1.10.3. Reacção de PCR
Na reacção de PCR foram utilizados as sequências iniciadoras MC: MC1 (5’- GTTAGCCGATGGTGGTCTTG-3’) e MC2 (5’CACCCATTTTTCCGATTTTG-3’) Cortes et al. (2004) a partir da sequência de DNA referida em 1.9.2. e usando o programa “Primer 3 (Whitehead)” (The Rockefeller University, USA). A utilização destas sequências iniciadoras resulta num produto de amplificação de PCR de 447 pb. Preparou-se, para cada amostra (5 µl de DNA), 45 µl de uma mistura de
reacção constituída por 16 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.2 mM
dNTP’s, 1.5 mM MgCl2, 1 µM de cada sequência iniciadora (MC1 e MC2) e 1 U de
Taq DNA polymerase. As condições óptimas para as amplificações por PCR foram as
seguintes: desnaturação de 2 minutos a +94 oC e 30 ciclos de 20 segundos a +94 ºC
(desnaturação), 20 segundos a +60 oC (ligação) e 30 segundos a +72 oC (elongação);
no fim dos ciclos, uma elongação final de 5 minutos a +72 ºC. Os produtos de amplificação, constituídos por 447 pb, foram visualizados num gel de agarose a 1.5 %
em 1X tampão TAE corado com 0.5 µg/ml de brometo de etídio. Foi aplicado no gel
um marcador de massa molecular de 100 pb de DNA.
Como controlo positivo da execução técnica usou-se o gene constitutivo da β- actina, uma das proteínas que constituem o citoesqueleto. Preparou-se, para cada amostra (2 µl de DNA), 18 µl de uma mistura de reacção constituída por 16 mM
(NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.2 mM dNTP’s, 1.5 mM MgCl2, 1 µM de
cada sequência iniciadora (“forward”: 5’-
TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’ e “reverse” 5’-
CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’) e 1 U de Taq DNA polymerase. As condições óptimas para as amplificações por PCR foram as seguintes:
5 minutos a +94 oC e 40 ciclos de 30 segundos a +94 ºC, 30 segundos a +64 oC e 30
segundos a +72 oC; no fim dos ciclos, uma elongação final de 7 minutos a +72 ºC.
Os produtos de amplificação, constituídos por 283 pb, foram visualizados num gel de agarose a 1.5 % como descrito anteriormente.
Em todas as amplificações utilizou-se como controlo positivo 1 L de DNA genómico de L. infantum e como controlo negativo água ultrapura em substituição do DNA.
A preparação das reacções de PCR foi realizada numa área independente, de forma a obviar possíveis contaminações.
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2.1.10.4. Reacção de qRT-PCR
No qRT-PCR, a utilização de compostos fluorescentes ligados a sondas de DNA que se vão ligando às cadeias duplas de DNA formadas durante a amplificação, permite a quantificação do produto de PCR durante a fase exponencial da reacção e, assim, a monitorização em tempo real da reacção de amplificação.
A aplicação de sondas TaqMan
nos sistemas de qRT-PCR permite a quantificação dos produtos de PCR devido à actividade nuclease da Taq DNA polimerase na extremidade 5’ da sonda (Heid et al., 1996). Esta particularidade permite a fragmentação da sonda hibridada e libertação do composto fluorescente (6- FAM). O uso de curvas-padrão permite a quantificação dos parasitas nas amostras.
As amostras de DNA foram analisadas usando os oligonucleótidos (Applied Biosystems) 5’-GGTTAGCCGATGGTGGTCTT-3’ (“primer forward”), 5’- GCTATATCATATGTCCAAGCACTTACCT-3’ (“primer reverse”) e a sonda
TaqMan
(5’-ACCACCTAAGGTCAACCC-3’), resultando um produto de amplificação de 90 pb.
As reacções de PCR foram processadas no sistema ABI PRISM
5700 System (Perkin-Elmer, Applied Biosystems). 2 l de amostra de DNA foram adicionados a 18
l de uma mistura de reacção constituída por 10 l de 2x TaqMan
Universal PCR
Master Mix, No AmpErase
UNG (Applied Biosystems), 0.5 l da mistura de
sequências iniciadoras e sonda TaqMan
MGB (FAMTM dye-labeled, Applied
Biosystems) e 7.5 l de água ultrapura.
Todas as amostras foram testadas em duplicado. 2.1.10.5. Determinação da Carga Parasitária
Os valores obtidos por qRT-PCR foram “normalizados” em relação à concentração de DNA das amostras. A adopção desta metodologia teve por objectivo corrigir possíveis variações durante a pesagem das amostras ou no processo de extracção de DNA, bem como permitir a comparação de resultados de carga parasitária entre amostras de tecidos de estrutura sólida (baço, fígado, gânglio e pele), em que são utilizadas unidades de massa e de tecidos no estado líquido (medula óssea e o sangue periférico), em que são utilizadas unidades de volume.
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O número de parasitas presentes nos 2 l de DNA utilizados na PCR foram relacionados com a concentração de DNA da respectiva amostra, de modo a apresentar os valores de carga parasitária (CP) em número de parasitas por g de DNA.
CP = carga parasitária;
N = número de parasitas obtido pela técnica de qRT-PCR;
P = quantidade de solução de DNA utilizada na técnica (2 l) e o volume total de DNA eluído na extracção (100-200 l).
2.1.11. Análise Histopatológica
Na leishmaniose visceral, com progressão da infecção, verifica-se o aparecimento de alterações histopatológicas em vários órgãos, pelo que durante a necrópsia foram recolhidos fragmentos de baço, fígado, pele da região do focinho, gânglio mesentérico e globo ocular com estruturas adjacentes.
A análise histopatológica foi efectuada pela Professora Mª da Conceição Peleteiro, do Departamento de Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária Universidade Técnica de Lisboa.
Os fragmentos dos diferentes tecidos foram conservados em formol a 10% até ao seu processamento. Este foi executado de acordo com a rotina do laboratório de Anatomia Patológica, seguindo os procedimentos habituais com inclusão em parafina e coloração pela hematoxilina-eosina.