T.  Geronimo  Johnson’s  Welcome  to  Braggsville

A atividade de cada enzima pode ser regulada por alguns aminoácidos, análogos de aminoácidos e co-fatores da reação. No caso pontual da via metabólica do aspartato, já é conhecido o fato de que algumas das enzimas desta via são altamente reguladas pelos seus próprios produtos finais (lisina, treonina, isoleucina e SAM) (AZEVEDO et al., 2006).

No intuito de estudar a influência de alguns destes compostos no comportamento da enzima HK, foi determinada a atividade da enzima em relação a tratamentos com a adição de diferentes aminoácidos: lisina, treonina, metionina e isoleucina, assim como com o cofator SAM em diferentes concentrações (0,1, 0,5, 1,0 e 5 mM) (Figura 22) para estudar o efeito dos mesmos na reação. Para estes ensaios foram utilizadas sementes imaturas (14 DAP) de cada linhagem, visto que a maior atividade desta enzima se encontra neste estágio, nas três linhagens estudadas.

Figura 22 - Gráfico representando o efeito da adição de diferentes aminoácidos: L- lisina, M- metionina, T- treonina e I- isoleucina e o co-fator: S- s-adenosilmetionina (SAM) em quatro diferentes concentrações: 0,1- 0,1 mM, 0,5- 0,5 mM, 1- 1,0 mM e 5- 5,0 mM sobre a atividade relativa da enzima homoserina quinase isolada de sementes imaturas (14 DAP) da linhagem 161q.

Os aminoácidos lisina, treonina, metionina e isoleucina são sintetizados pela via metabólica do aspartato, a enzima HK, que participa desta via, foi testada na presença dos quatro aminoácidos, produto final da via do aspartato e também pelo co-fator SAM (Figura 22). Os resultados obtidos na Figura 22 mostram que apenas o SAM na concentração de 1 mM induz a atividade da HK na reação, aumentando em 62% a atividade da enzima. Os outros aminoácidos testados, em diferentes concentrações, levam a uma inibição da atividade enzimática.

Com uma concentração de 5 mM, os aminoácidos metionina e treonina, assim como a isoleucina com 0,5 mM foram os que levaram a uma maior inibição da atividade de HK, com 98,7, 84,2 e 77,8% de inibição, respectivamente.

As menores inibições ocorreram com a adição dos aminoácidos treonina (0,5 mM), lisina (0,1 mM) e isoleucina (1,0 mM) com inibições de 23,6, 30,2 e 32%, respectivamente.

Na concentração de 0,1 mM, o aminoácido metionina e a SAM levaram a uma inibição de 50%, a isoleucina de 46%, a treonina de 34% e a lisina de 30%. Na concentração de 0,5 mM a isoleucina levou a uma maior inibição (84%), e a treonina à menor inibição da atividade da enzima. A SAM na concentração de 1 mM induziu a atividade da enzima, e os aminoácidos metionina e isoleucina tiveram a maior (59%) e a menor inibições (32%), respectivamente. Na concentração de 5 mM a metionina e a isoleucina inibiram a atividade de HK, a adição de isoleucina levou à menor inibição (43%).

4.5 Eletroforese Bidimensional

O fato de o estudo ser focado em três linhagens, das quais duas são de alta lisina, é de grande interesse compreender o comportamento que leva ao acúmulo de lisina nestas linhagens. Assim, foi realizada uma caracterização bidimensional da fração protéica zeína de cada linhagem, a fim de se obter mais informações sobre a mesma.

A Figura 23 apresenta os géis bidimensionais da fração zeína das três linhagens, as setas verdes apresentam os spots que se diferenciaram, aumentando sua expressão, nas linhagens 161 e 161q, quando comparadas com a L161n, e as vermelhas indicam os spots que apresentaram uma diminuição de sua expressão, em relação à L161n. Neste estudo não foram detectados spots exclusivos em nenhuma das três linhagens.

Figura 23 - Perfil de distribuição de proteínas da fração zeína de endosperma de milho. A – Linhagem 161n, B – Linhagem 161o e C – Linhagem 161q. Corado com CBB G-250. As setas verdes indicam os spots com maior expressão, e as vermelhas com menor expressão, em relação à L161n. Apenas a região contendo as isoformas é apresentada na figura. IF conduzido entre pH 3-10 NL

Comparando-se a linhagem 161n com as L161o e L161q, nota-se uma grande diferença entre os perfis de proteínas expressas, tanto na quantidade de spots presentes, como na intensidade de alguns spots (Figura 23), porém a diferença mais contrastante foi observada entre as linhagens 161n e 161o, e assim como já foi observado no gel SDS-PAGE, a L161o não apresentou a fração de 22 kDa, presente na L161n.

As setas em vermelho representam os spots que estão em menor intensidade quando comparados com os da linhagem 161n, dois spots da -zeína com 19 kDa nas linhagens 161o e 161q, e um spot da -zeína com 14 kDa na L161o. As setas em verde apontam os spots com uma maior intensidade em relação à L161n, mostrando que a proteína -zeína apresentou uma aumento tanto na de 27 kDa como na de 16 kDa, na L161o, sendo que esta linhagem também apresentou um aumento na -zeína de 10 kDa. A L161q apresentou aumento na -zeína de 16 kDa e na -zeína.

Na semente de milho o endosperma representa o tecido de reserva de nutrientes e é o responsável pela germinação e primeiras etapas do desenvolvimento da plântula, assim, foi analisado o perfil de distribuição de proteínas expressas nas três linhagens (Figura 24).

Figura 24 - Perfil 2D-PAGE da proteína total de sementes maduras de milho. A – Linhagem 161n, B – Linhagem 161o e C – Linhagem 161q. Corado com CBB G-250. IF conduzido entre pH 3-10 NL

Foi observado que o perfil protéico bidimensional das proteínas teve concordância na distribuição de tamanhos das proteínas, entre 15 e 120 kDa, com o perfil obtido através de SDS- PAGE.

O estudo do perfil protéico bidimensional foi realizado comparando as linhagens 161o e 161q com a L161n e também as linhagens 161o e 161q entre si, a fim de se obter um maior número de informações sobre as diferenças encontradas nas três linhagens.

Embora no perfil das proteínas totais o número de spots obtidos tenha sido muito alto nas diferentes linhagens, apenas poucas proteínas se diferenciaram e caracterizaram cada linhagem. Com tudo, deve-se ressaltar que as comparações de spots, visaram incluir nas análises aqueles spots que fossem nítidos e de maior concentração.