T EKNOLOGISTATUS FOR FABRIKASJON AV THORIUMBRENSEL

Na tabela 7 encontram-se registados os valores de CMI obtidos para as 4 estirpes estudadas, sendo 2 Gram positivo e 2 Gram negativo. Na tabela 8 figuram os resultados de CMB, obtidos a partir do terceiro ensaio de avaliação do potencial antimicrobiano.

Tabela 7 - Concentrações mínimas inibitórias (CMI), em mg/mL, dos extratos analisados. MC - extrato obtido por maceração da casca; MP - extrato obtido por maceração da polpa; USC – extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da casca; USP – extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da polpa. CMI (mg/mL) MC MP USC USP E.coli ATCC 25922 > 250,0 > 250,0 250,0 > 250,0 P.aeruginosa ATCC 17853 250,0 250,0 250,0 250,0 B.cereus ATCC 11778 31,25 31,25 31,25 31,25 S.aureus ATCC 25923 125,0 250,0 125,0 250,0

Tabela 8 - Concentrações mínimas bactericidas (CMB), em mg/mL, dos extratos analisados. MC - extrato obtido por maceração da casca; MP - extrato obtido por maceração da polpa; USC – extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da casca;USP – extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da polpa. CMB (mg/mL) MC MP USC USP E.coli ATCC 25922 > 250,0 > 250,0 > 250,0 > 250,0 P.aeruginosa ATCC 17853 > 250,0 > 250,0 > 250,0 > 250,0 B.cereus ATCC 11778 > 250,0 > 250,0 > 250,0 > 250,0 S.aureus ATCC 25923 > 250,0 > 250,0 > 250,0 > 250,0

As figuras 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15 apresentam os registos fotográficos relativos às microplacas onde foi realizado o ensaio de determinação da CMI.

Figura 8 - Resultados obtidos com a estirpe Escherichia coli ATCC 25922. Linhas A, B e C – extrato obtido por maceração da casca; Linhas F, G e H – extrato obtido por maceração da polpa

Figura 9 - Resultados obtidos com a estirpe Escherichia coli ATCC 25922. Linhas A, B e C - extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da casca; Linhas F, G e H – extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da polpa.

Figura 10 - Resultados obtidos com a estirpe Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Linhas A, B e C – extrato obtido por maceração da casca; Linhas F, G e H – extrato obtido por maceração da polpa.

Figura 11 - Resultados obtidos com a estirpe Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Linhas A, B e C - extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da casca; Linhas F, G e H – extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da polpa.

Figura 12 - Resultados obtidos com a estirpe Bacillus cereus ATCC 11778. Linhas A, B e C – extrato obtido por maceração da casca; Linhas F, G e H – extrato obtido por maceração da polpa.

Figura 13 - Resultados obtidos com a estirpe Bacillus cereus ATCC 11778. Linhas A, B e C - extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da casca; Linhas F, G e H – extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da polpa.

A B C A B C A B C A B C A B C A B C F G H F G H F G H F G H F G H F G H

Figura 14 - Resultados obtidos com a estirpe Staphylococcus aureus ATCC 25923. Linhas A, B e C – extrato obtido por maceração da casca; Linhas F, G e H – extrato obtido por maceração da polpa.

Figura 15 - Resultados obtidos com a estirpe Staphylococcus aureus ATCC 25923. Linhas A, B e C - extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da casca; Linhas F, G e H – extrato obtido com recurso a banho de ultrassons da polpa.

A partir da análise das duas tabelas pode verificar-se que a estirpe com que foi possível obter resultados de CMI mais baixos foi B.cereus, tendo sido obtidas as CMI de 31,25 mg/mL. Através da diferença de valores de CMI obtidos para os vários extratos analisados no que corresponde à estirpe de S.aureus pode inferir-se a existência de um composto ao nível da casca da maçã BE que possa originar um valor mais baixo de concentração do extrato bruto. Para a estirpe de

P.aeruginosa, e por comparação com os resultados em Anexo III, pode verificar-se que a CMI

obtida foi de 250 mg/mL. Apesar de existirem poços da microplaca nos quais não é evidente a coloração rosa característica da presença de microrganismos após a adição de resazurina, apenas a primeira coluna das diversas placas em que foi testada esta estirpe se verifica a existência de uma coloração mais escura, e sem que exista crescimento bacteriano. Relativamente ao microrganismo E.coli, verifica-se que apenas o extrato USC, obtido com recurso a banho de ultrassons e cuja matriz em análise era a casca da maçã BE apresentou inibição do crescimento. Este fator pode resultar do facto de, devido à maior rutura das paredes celulares e consequente libertação de um maior número de biomoléculas, poder existir um composto que, embora em concentrações elevadas, seja responsável pela inibição do crescimento.

Através dos resultados apresentados na tabela 8, e por comparação com os valores de CMI obtidos e registados na tabela 7, pode concluir-se que com os valores de CMI indicados apenas ocorre inibição do crescimento das quatro estirpes em estudo, não sendo provocada a morte das mesmas.

Através da análise das microplacas pode ainda concluir-se que, na concentração utilizada como solvente dos extratos brutos, o DMSO a 2% (v/v) não exerce influência nos resultados obtidos, tendo sido verificado crescimento bacteriano em todos os poços onde se realizou o CTS.

F G H F G H A B C A B C

Os resultados obtidos não se encontram de acordo com os previamente descritos na literatura, sendo superiores a estes. Pires et al.[50] utilizaram snacks de maçã BE, previamente descascados e desidratados e como solvente uma mistura hidrometanólica (metanol/água 80:20) para obter extratos. Após análise da atividade antimicrobiana, com recurso a estirpes isoladas de amostras de pacientes hospitalizados foram obtidos os valores de 5 mg/mL para

E.coli e S.aureus suscetível à metilcilina e um valor de concentração superior a 20 mg/mL para P.aeruginosa.[50]

Num outro estudo, elaborado por Zambrano et al.[58], com recurso a uma mistura hidroetanólica (etanol/água, 10:90), e a partir de resíduos de Malus domestica cv. Jonagold, os valores de CMI obtidos demonstraram ser superiores aos reportados no presente relatório para a estirpe de B.cereus, para a qual foi obtida a CMI de 100 mg/mL. Para as culturas de

S.aureus e E.coli, os resultados reportados por Zambrano encontram-se concordantes com os

obtidos no presente estudo, sendo de CMI > 100 mg/mL. Contudo, para a bactéria P.aeruginosa, os autores do trabalho anteriormente referido reportam CMI de 100 mg/mL, resultado inferior ao obtido no presente relatório, de 250mg/mL.[58]

Ainda num terceiro estudo, Unnisa et al.[60] obtiveram extratos aquosos e etanólicos a partir de amostras frescas e posteriormente liofilizadas de Malus domestica, avaliando posteriormente a sua bioatividade contra estirpes isoladas de feridas de doentes. Através de diluições de 1:2 dos extratos brutos obtidos, os extratos etanólicos demonstraram como CMI 6 mg/mL para as estirpes isoladas de S.aureus e P.aeruginosa. Estes valores são então consideravelmente mais baixos que os obtidos no trabalho desenvolvido. De forma semelhante, para a estirpe de E.coli isolada, os valores de CMI alcançados por Unissa foram de 10 mg/mL, valores inferiores aos obtidos no presente relatório. A determinação de valores inferiores mantém-se para as estirpes de E.coli e S.aureus, aquando da utilização de extratos aquosos. A diferença de valores obtidos pode dever-se não só às diferenças nos solventes e matrizes de extração utilizadas, mas também à suscetibilidade que os microrganismos isolados podem apresentar aos diferentes agentes com ação antibacteriana.[60]

Os valores de CMB não permitiram a comparação direta com outros valores obtidos a partir de

Malus domestica cv. Bravo-de-Esmolfe. Uma vez que se trata de uma variedade regional, com

origem genética em Esmolfe, não tendo sido encontrados estudos comparáveis com o realizado. No entanto, apesar da impossibilidade de comparação de resultados, os mesmos permitem concluir que a cultivar estudada não possui ação bactericida para concentrações inferiores a 250 mg/mL. Estes resultados são concordantes com os resultados de Zambrano et al. uma vez que os valores de CMB reportados para as diversas estirpes são > 100 mg/mL, para as diversas estirpes testadas.[58]

Os registos fotográficos dos resultados obtidos na determinação dos valores de CMB encontram- se em anexo. (Anexo IV)