Os organismos indicadores de contaminação fecal avaliados foram os coliformes totais e Escherichia coli (como indicadores de bactérias), Clostridium perfringens (indicadores de protozoários) e colifagos (indicadores de vírus entéricos). Os exames microbiológicos foram realizados no Laboratório de Tratamento de Resíduos Orgânicos da EESC/USP.
4.12.2.1. Coliformes totais e E. coli
As bactérias do grupo coliforme, que incluem a E. coli, são Gram-negativas, não formadoras de esporos, aeróbias ou anaeróbias facultativas que fermentam lactose, produzindo ácido e gás (BLACK, 2002).
Para a quantificação de coliformes foi utilizada a técnica de filtração em membrana usando como meio de cultura Chromocult® Coliform Agar (Merck - Cat. 1.10426). Este meio permite a determinação simultânea de coliformes totais e E.coli. Para a preparação do meio 26,5 g do Chromocult® Coliform Agar eram dissolvidos em 1000 mL de água destilada, aquecendo-se em banho-maria, sem que a temperatura ultrapassasse 70ºC. Em seguida volumes de 10 mL eram distribuídos em placas de Petri. Após solidificação do meio, as placas eram mantidas sob refrigeração até o uso. Considerando que este meio de cultura não deve ser autoclavado, toda a vidraria utilizada no seu preparo era esterilizada (autoclavada a 121ºC por 15 minutos), além de se realizar uma rigorosa desinfecção na bancada de trabalho.
O procedimento para quantificação dos microrganismos consistiu na filtração de 100 mL de amostra diluída através de membrana de 0,45 µm (Gelman GN6). Após a filtração, a membrana contendo bactérias era colocada em placa de Petri sobre o meio de cultura, e incubada a 36ºC ± 1ºC por 24 h ± 1h. Após o tempo de incubação, a contagem das unidades formadoras de colônias (UFC) era realizada baseada na seguinte coloração para identificação dos microrganismos: azul escuro a violeta para E. coli e vermelho a salmão para coliformes totais. Os resultados foram expressos em UFC/100 mL.
O princípio do método utilizando o meio Chromocult® Coliform Agar baseia-se na detecção de três enzimas, sendo uma específica do grupo coliforme total (ư- galactosidase), e duas características de E. coli (ư-glucuronidase e tryptophanase). Para detectar a enzima ư-galactosidase, o meio contém substrato cromogênico 6-cloro-3-indolil-
3-ư-D-galactopiranoside (SALMON-GAL). Em hidrólise por ư-D-galactosidase, SALMON-GAL libera um composto cromogênico (cloroindigo) que forma colônias de coloração salmão a vermelho. Para a detecção de ư-glucuronidase, o meio de cultura possui um outro substrato cromogênico, ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-ư-D-glucurônico, sal ciclohexilamônio (X-GLUC). Em hidrólise por ư-glucuronidase, X-GLUC libera um composto cromogênico (bromocloroindigo) que forma colônias azul claro a turquesa. E.
coli produz tanto ư-galactosidase quanto ư-glucuronidase que penetram em SALMON-GAL
e X-GLUC, respectivamente. A hidrólise simultânea desses substratos cromogênicos forma colônias de cor azul escuro a violeta, facilmente diferenciadas de outras colônias de coliformes (USEPA, 2002).
4.12.2.2. Colifagos
Os colifagos são vírus que infectam bactérias do grupo coliformes, e são utilizados como indicadores de vírus entéricos. Quando os colifagos infectam e se reproduzem em cepas de E. coli, provocam a lise celular de sua hospedeira que, em placa de agar, é caracterizada pelo surgimento de zonas transparentes denominadas placas de lise. A quantificação dos colifagos baseia-se na contagem das unidades formadoras de placa (UFP) em Placa de Petri, e foi realizada seguindo o método de ensaio CETESB/L5.225 (CETESB, 1990).
Preparação da suspensão da E. coli hospedeira
Como bactéria hospedeira dos colifagos foi utilizada cepa de Escherichia coli CIP 55.30 (meio NA – agar nutriente) adquirida da Fundação Tropical de Pesquisas e Tecnologia "André Tosello", em Campinas, SP.
O meio de cultura utilizado para o crescimento e manutenção da bactéria hospedeira foi o TSB (Tryptic Soy Broth), Difco 0370-17. Para cada 30 g do meio TSB eram adicionados 1000 mL de água destilada, levando ao aquecimento em bico de Bunsen até completa dissolução, sem atingir a temperatura de ebulição. Após o preparo do meio, transferia-se volumes de 10 mL para tubos de ensaio, e volumes de 90 mL para erlenmeyers, autoclavando-se em seguida a 121ºC por 15 minutos. O meio TSB, após autoclavado, era mantido em geladeira até seu uso para preparação da suspensão da
bactéria E. coli, hospedeira dos fagos.
As etapas para a repicagem da E. coli hospedeira dos fagos para o meio TSB são apresentadas a seguir:
• com uma alça de platina previamente esterilizada (com a chama do bico de Bunsen) transferia-se uma pequena porção da cultura estoque de E. coli (CIP 55.30) para o tubo de ensaio contendo 10 mL de TSB, levando-se para estufa a 36ºC por 18 a 24 horas;
• após a incubação, o conteúdo do tubo de ensaio com a E. coli repicada era transferido para o meio TSB (90 mL) do erlenmeyer, e depois homogeneizado e levado para estufa a 36ºC por 1 hora;
• após este período, adicionava-se 10 mL de glicerol (previamente autoclavado a 121ºC por 15 minutos) ao conteúdo do erlenmeyer, e, sob agitação, transferia-se alíquotas de 1,0 mL para flaconetes estéreis. Os flaconetes com a suspensão de E.
coli hospedeira eram mantidos em congelador até seu uso.
Quantificação dos colifagos
Para os exames de colifagos o meio de cultura utilizado foi o TSA (Tryptic Soy Agar) modificado, com a seguinte composição (Tabela 4.7):
Tabela 4.7 – Composição do TSA modificado.
Componentes Quantidades
TSA (Difco) 40,0 g Nitrato de amônia – NH4NO3 p.a. 1,6 g
Nitrato de estrôncio – Sr (N03)2 0,21 g
Aos componentes da Tabela 4.7 eram adicionados 1000 mL de água destilada, levando ao aquecimento em bico de Bunsen até total dissolução, sem atingir a temperatura de ebulição. O meio era então distribuído em tubos de ensaio (16x150 mm), em volumes de 5,5 mL, e autoclavado a 121ºC por 15 minutos. Os tubos de ensaio com o TSA modificado eram conservados em geladeira, até o momento dos exames.
Para a quantificação dos colifagos, o seguinte procedimento foi adotado:
• para cada amostra de esgoto eram tomados quatro tubos de TSA modificado, os quais eram fundidos em banho-maria a 44,5ºC;
minutos. Para aquelas em que se esperava acima de 1000 colifagos/100 mL eram feitas diluições;
• para cada um dos quatro tubos contendo TSA modificado eram transferidos 5 mL da amostra ou de sua diluição, mais 1 mL da suspensão de E. coli contida nos flaconetes;
• o conteúdo de cada tubo era então homogeneizado e vertido em placa de Petri; • novamente efetuava-se a homogeneização do meio vertido na placa, com
movimentos circulares em forma de 8;
• após a solidificação do meio, as placas eram incubadas a 36°C±1ºC por 4 a 6 horas.
Todo o procedimento era realizado próximo à chama do bico de Bunsen.
Leitura e expressão dos resultados
Após o período de incubação a contagem das placas de lise formadas no agar era efetuada. O número de colifagos era obtido multiplicando-se por cinco a somatória das placas de lise nas quatro placas de Petri utilizadas por amostra, e pela diluição quando necessário. O resultado é expresso como número de unidades formadoras de placas por 100 mL (UFP/100 mL).
4.12.2.3. Clostridium perfringens
Clostridium perfringens é uma bactéria anaeróbia obrigatória, Gram-positiva,
formadora de esporos, de origem exclusivamente fecal, patogênica, podendo causar gangrena gasosa e intoxicação alimentar (BLACK, 2002). Devido à característica de formar esporos, é bastante resistente às condições ambientais adversas (calor, dessecação, congelamento, radiação) e aos desinfetantes, e por isso utilizada como indicador de protozoários.
A metodologia utilizada para determinação da concentração de Clostridium perfringens foi baseada na técnica de tubos múltiplos, descrita no método de ensaio CETESB/L5.213 (CETESB, 1993).
Utilizou-se o meio diferencial enriquecido para clostrídios de concentração simples - DRCM (Diferencial Reinforced Clostridium Medium) na fase presuntiva (Tabela 4.8), em
que os clostrídios presentes na amostra reduzem o sulfito (sulfito de sódio) adicionado ao meio, formando sulfeto de hidrogênio (H2S) que provoca a turvação ou enegrecimento do
meio de cultura. Na fase confirmativa foi utilizado como meio de cultura o leite tornassolado (Litmus Milk) composto por leite desnatado e um indicador, no caso o tornassol. Os clostrídios sulfito-redutores têm a propriedade de fermentar o leite tornassolado de forma característica, provocando a coagulação do caseinogênio. No processo, a lactose é fermentada produzindo ácido e gás, causando o rompimento dos coágulos. A produção de ácido é responsável pela mudança da coloração do meio de lilás para rosa devido ao indicador de pH, o tornassol.
Tabela 4.8 - Composição do meio diferencial para Clostridium perfringens (DRCM).
Componentes Quantidades
Peptona 10,0 g
Extrato de carne purificado em pó 10,0 g Acetato de sódio hidratado 5,0 g Extrato de levedura 1,5 g Amido solúvel 1,0 g
Glicose 1,0 g
L-cisteína 0,5 g
Água destilada 1000 mL
Os meios de cultura DRCM e leite tornassolado, após preparo, eram autoclavados a 121ºC por 15 minutos e conservados em geladeira até o momento de uso.
Os resultados são apresentados como número mais provável por 100 mL (NMP/100 mL).