4 RESULTS
4.1 FINDINGS FROM THE LITERATURE
Conforme já foi mencionado, os heparinóides desempenham importantes papeis com relação a muitos processos que tem por base o sistema imunológico e a cascata de coagulação. Estes dois processos estão intrinsecamente ligados pois as proteases da cascata de coagulação induzem a síntese de mediadores pro- inflamatórios que tem atividade pro-anticoagulante, amplificando assim, a cascata de coagulação (LEVI, 2003). A inflamação aguda, como uma resposta à infecção severa ou trauma, resulta em uma ativação sistêmica do processo de coagulação. Portanto, o processo inflamatório tem relação direta com o sistema de coagulação.
crustáceo e sabendo-se que existe uma interrelação entre coagulação e inflamação resolvemos verificar o efeito destes compostos no processo inflamatório. Uma justificativa adicional para o direcionamento deste trabalho neste sentido, relacionou-se com o fato dos heparinóides deste crustáceo ter em peculiaridades estruturais como baixas massas moleculares e diferentes graus de sulfatação em relação as heparinas comerciais.
A fração 3,0 M obtida da Artemia franciscana foi utilizada para os testes de inflamação induzida por tioglicolato de sódio a 3% em ratos Wistar. O nosso objetivo estava centrado em verificar as potencialidades desta fração no processo de inibição da migração de células (leucócitos) para o local da inflamação. Teria este composto os grupamentos capazes para reconhecer os sítios das moléculas adesivas impossibilitando desta forma que esta molécula chegue a se tornar competidora pelos sítios das L- e P- selectinas ?
Xie et al. (2000) utilizando derivados quimicamente modificados da heparina em um modelo de inflamação aguda mostraram, uma redução da migração de neutrófilos em torno de 58-73% em relação ao grupo controle. Trabalhos realizados por Wang et al. (2002) também demonstraram a ação inibitória da heparina em animais deficientes em P e L-selectinas sendo observado uma redução na infiltração de neutrófilos da ordem de 50%.
A Analise de Variância (ANOVA), realizada com o grupo controle positivo e negativo, e os grupos experimentais da heparina padrão (Figura 18), apresentaram diferenças significantes entre as médias (p<0,001). O pós teste de Tukey-Kramer para o controle positivo e negativo foram considerados
parâmetro para comparação dos grupos experimentais constituídos de heparina padrão, heparina desaminada e fração F-3,0M de Artemia franciscana.O pós teste de Tukey-Kramer confirmou as diferenças entre o controle positivo (TG) e a heparina padrão nas concentrações de 5 µg/Kg (p<0.001) e 10 µg/Kg (p<0.05). Por outro lado, não foram observadas diferenças entre o controle positivo e a heparina padrão nas concentrações 15, 20, 25µg/Kg. As diferenças observadas entre o controle negativo foram significantes para todos os grupos experimentais (p<0.001). Quando comparada a eficácia das diferentes concentrações da heparina padrão, constatou-se que a redução do número de leucócitos na concentração de 5 µg/Kg foi significante em relação a concentração de 10µg/Kg (p<0.05). As concentrações de 15, 20 e 25 µg/Kg obtiveram um valor de p<0.01. Ao se comparar a heparina padrão na concentração de 10 µg/Kg com os grupos 15, 20 e 25 µg/Kg as diferenças entre o número de células não foram estatisticamente significantes (p >0.05).
Heparina Padrão 0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 Contr ole+ Contr ole- 5 10 15 20 25 Número de celulas (mm3)
Figura 18. Efeito da fração de heparina padrão na migração de leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio.
O gráfico representa a comparação entre as médias do número de leucócitos do líquido peritoneal 3 horas após a administração intraperitoneal de tioglicolato de sódio a 3% grupo controle positivo) salina estéril a 0,9% (grupo controle negativo) e Heparina nas concentrações de 5,10,15,20,25 µg/Kg.
Partindo do princípio de que a heparina padrão tem ação sobre as P e L- selectinas, resolvemos verificar a ação de uma heparina quimicamente modificada sobre este sistema. A figura 19 apresenta o número de leucócitos para os grupos experimentais com a heparina desaminada nas concentrações de 5, 10, 15 , 20 e 25 µg/Kg. A análise de variância (ANOVA) apresentou diferenças significantes entre o controle positivo, negativo e os grupos experimentais. O pós teste de Tukey-Kramer identifcou que as diferenças entre as médias do controle positivo e
controle negativo, apenas as médias dos grupos de concentrações 15 e 25 µg/Kg apresentaram diferenças significantes, ou seja, apesar destas concentrações a heparina desaminada não conseguiu trazer o número de leucócitos a níveis basais. Heparina Desaminada 0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 C ont rol e + Co ntrol e - 5 10 15 20 25 Número de celulas (mm3)
Figura 19 . Efeito da heparina desaminada na migração de leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio.
O gráfico representa a comparação entre as médias do número de leucócitos do líquido peritoneal 3 horas após a administração intraperitoneal de tioglicolato de sódio a 3% (controle positivo) e salina estéril a 0,9% (grupo controle negativo) e Heparina nas concentrações de 5,10,15,20,25 µg/Kg.
(ANOVA) apresentou diferenças entre as médias (figura 20). O pós teste de Tukey-Kramer demonstrou que as diferenças se deram entre o controle positivo e o grupo experimental em todas as suas concentrações (p<0,0001). O número de leucócitos no grupo F-3,0 M (20 µg/Kg) não foi reduzido ao padrão de normalidade quando comparado com o controle negativo (p<0,05). A média do número de células do grupo F-3,0M na concentração de 10 µg/Kg foi menor que aquelas encontradas nos grupos F-3,0 M com 15 µg/Kg (p<0,05) e F-3,0 M quando utilizado 20 µg/Kg (p<0,01). Nas concentrações de 15 µg/Kg e 20 µg/Kg não existiram diferenças (p>0,05). F 3,0 M Artemia franciscana 0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 Cont role + Cont role- 10 15 20 N ú me ro de c e lul a s ( m m m 3 )
Figura 20. Efeito da fração F-3,0 M de Artemia franciscana na migração de leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio.
leucócitos do líquido peritoneal 3 horas após a administração intraperitoneal de tioglicolato de sódio a 3% (controle positivo) e salina estéril a 0,9% (controle negativo) e Heparina nas concentrações de 10,15,20 µg/Kg.
A comparação foi realizada primeiramente pela constatação de que na concentração de 10 µg/Kg para os diferentes grupos experimentais apresentaram diferenças estatísticamente significante em relação ao grupo controle positivo. Além disso, a atividade da heparina padrão no controle da inflamação é confirmado pelos seguintes trabalhos da literatura (KOENING et al, 1998; XIE et al, 2000). Ao se comparar os diferentes grupos experimentais na concentração de 10 µg/Kg constatamos que as diferenças foram significantes pela análise de variância (p<0,0001). As médias do número de leucócitos para a heparina padrão 10 µg/Kg (3702 mm3) foi maior quando comparado com a heparina desaminada 10 µg/Kg (3465mm3) e com a F3,0 M
Artemia franciscana 10 µg/Kg (3400 mm3) constatada pelo pós teste de Tukey-Kramer (p<0,0001). Os grupos experimentais testados com heparina desaminada e a F-3,0 M apresentaram um padrão de afinidade aumentada em relação a interação com a P ou L-selectinas.
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