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É a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. Na cromatografia, a curva analítica é construída plotando-se os valores de concentração do analito encontrado na amostra pela razão área do padrão/área do padrão interno.

4.6.2. Precisão

A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma corrida. É determinada utilizando-se, no mínimo 3 concentrações (baixa, média e alta), que estejam dentro do intervalo da curva de calibração, realizando-se 5 determinações por concentração. Considerou-se 2 níveis da precisão:

Precisão Intra-Ensaio: é a concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo, com o mesmo analista e mesma instrumentação.

Precisão Inter-Ensaio: é a concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.

Pode ser expressa como o desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) de uma série de medidas, em que o limite inferior de quantificação deve apresentar valores inferiores a 20% e os demais pontos valores inferiores a 15%. É calculado pela fórmula abaixo:

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Onde:

DPR: Desvio padrão relativo DP: Desvio padrão

CMD: Concentração média determinada

A validação da precisão foi realizada em 5 dias. Foram avaliadas as precisões intra-ensaio e inter-ensaio com a utilização de 5 replicatas para cada um dos 3 CQs (baixo, médio e alto). A precisão intra-ensaio foi calculada obtendo-se os coeficientes de variação dos controles de qualidade de cada composto dividindo-se o desvio padrão pela média aritmética em cada dia de análise. Para a precisão inter- ensaio, foi calculado o coeficiente de variação de todas as análises dividindo-se pela média aritmética de todas as análises, que foram 25 ensaios no total.

4.6.3. Exatidão

É a proximidade dos resultados obtidos pela metodologia estudada em relação ao valor verdadeiro. É calculada pela fórmula:

O parâmetro da exatidão é validado utilizando-se no mínimo 3 concentrações (baixa, média e alta) ao longo da faixa de variação da curva de calibração, com no mínimo 5 determinações por concentração. Os valores de exatidão aceitos podem variar de 80 a 120% para o limite inferior de quantificação e de 85 a 115% para os demais pontos. A exatidão da metodologia foi avaliada juntamente com a precisão, aplicando-se o cálculo nas médias das concentrações dos cinco dias de análises para cada controle de qualidade.

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4.6.4. Limite de detecção

É a menor quantidade de analito em uma amostra que pode ser determinada. É estabelecido por meio da análise de amostras fortificadas com soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectado, não necessariamente quantificado, em que a razão sinal/ruído seja 3:1.

Os experimentos foram realizados em duplicata, fortificando-se as amostras de mecônio com concentrações decrescentes, até que os picos cromatográficos dos compostos analisados apresentassem valores iguais ou maiores que 3 para a relação sinal/ruído, em ambas corridas.

4.6.5. Limite de quantificação

O limite inferior de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão (até 20%) e exatidão (80 – 120%) aceitáveis, sob as condições experimentais estabelecidas. O limite superior de quantificação é a maior quantidade de analito que pode ser determinada com precisão de até 15% e exatidão entre 85 e 115%.

O limite inferior de quantificação foi estabelecido por meio de análises de mecônio fortificado com concentrações decrescentes dos analitos até o menor nível quantificável, com precisão e exatidão aceitáveis, considerando-se também a razão sinal/ruído 10:1. O limite superior de quantificação foi determinado analisando-se as amostras de mecônio em concentrações crescentes até o valor de 1000ng/g para a cocaína e o cocaetileno e 1500 ng/g para a benzoilecgonina e o éster metilanidroecgonina.

4.6.6. Recuperação

A recuperação mede a eficiência do método em extrair os analitos de uma matriz biológica dentro de um limite de variação. Porcentagens de recuperação do analito e do padrão interno próximas a 100% são desejáveis, embora admita-se valores menores, desde que a metodologia seja precisa, exata. Foi determinada comparando-se os resultados de quantificação de amostras que foram fortificadas posteriormente à extração, com os resultados de quantificação das amostras que

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foram fortificadas anteriormente à extração. Os padrões internos foram adicionados anteriormente à extração nas duas situações, de forma que os resultados de quantificação obtidos pudessem avaliar a capacidade do solvente de extrair os analitos do mecônio quando fossem comparados com uma situação que, teoricamente, equivale a 100% de eficiência de extração. A recuperação foi avaliada nos 3 controles de qualidade (baixo, médio e alto).

4.6.7. Especificidade

É a capacidade do método em detectar e quantificar com exatidão aceitável um analito em presença de outros componentes, como impurezas, produtos de decomposição, metabólitos, medicamentos e os próprios componentes da matriz biológica. O limite inferior de quantificação não deve ser estar fora do intervalo de 80-120% quando calculado na presença dos interferentes investigados.

4.6.8. Carry over

O parâmetro carry over avalia a influência de uma análise anterior no resultado da análise seguinte, devido à presença de resíduos que possam ficar retidos em componentes do cromatógrafo, como liner, injetor, coluna, seringa e detector. Foi avaliado submetendo-se uma amostra de mecônio branco (amostra que não apresenta os analitos investigados) imediatamente após a análise do ponto mais alto da curva de calibração.