5 SOSIALE MEDIER OG VALGKAMP
5.8 Studiens begrensninger og videre forskning
Em trabalho anterior, realizado pelo Dr. Tatsuya com apoio da Fundecitrus, escolheu-se um pé de laranjeira infectado pela doença da morte súbita dos citros em Comendador Gomes e este foi denominado como P15. Retiraram-se as folhas infectadas e realizou-se uma extração de RNA, o qual foi verificado uma grande semelhança com RNAs da família Marafivirus. No presente trabalho realizou-se um novo seqüenciamento completo desse genoma com primers previamente confeccionados pelo Dr. Tatsuya Nagata (tabela 1), o qual observou-se uma nova confirmação de que esse genoma pertence a família Marafivirus, já que, foi observado que este genoma apresenta 95 % de identidade com o genoma anteriormente seqüenciado (DQ185573) do mesmo isolado P15 (www.ncbi.nlm.nih.gov) e 87% com outro isolado relatado (AY884005) por “pairwise” alinhamento múltiplo (ClustalW).
Preparação da extremidade 5’ do genomapara ser inserido no vetor
Após o seqüenciamento, decidiu-se por fusionar o fragmento P15507, que vai da extremidade 5’ ate a base 3529 ao promotor 35S do CaMV (P35S). O fragmento P15507 foi amplificado com os primers P26 (reverse) e P73 (forward) (tópico 1.3.2), sendo que o primer P73 se anela na região 5’ e o primer P26 se anela aproximadamente na base 3529, logo após o sítio de restrição KpnI.
Já o promotor 35S foi amplificado com os primers P72 (reverse) e P71 (forward) (tópico 1.3.1) originando um fragmento de aproximadamente 500 pb. A fusão de ambos os fragmentos originou um fragmento de aproximadamente 4000 pb (Figura 15).
Figura 15 Comparação entre a extremidade 5’ do vírus e o promotor 35S + 5’ do vírus. M: Marcador 1Kb Plus (Invitrogen); 1: 5’ do vírus (3438 pb) ; 2: PCR de fusão (3938 pb).
Seleção de clones contendo P35S e a extremidade de 5’ do vírus por digestão de enzimas de restrição e a preparação do inserto
Ao se tentar separar o vetor de clonagem pCR4 TOPO TA sequencing vector (Invitrogen) do inserto (P35S+5’ do vírus) ocorreu um imprevisto, pois o vetor possui aproximadamente 4000 pb e o inserto também, o que dificultava no procedimento de purificação de banda. Decidiu-se por realizar uma digestão tripla, utilizando-se as enzimas de restrição necessárias para separar o vetor do inserto (AscI e KpnI) e uma terceira enzima que não digerisse o inserto e que o vetor tivesse o sítio de restrição para a mesma, no qual a escolhida foi SspI. Com isso o resultado do gel de agarose apresentou três fragmentos, sendo que o fragmento maior de 4000 pb era o inserto, e os outros dois fragmentos eram o vetor pCR4 TOPO. Foram analisados 20 clones e os que apresentaram o resultado esperado foram os clones 13 e 14 (Figura 17).Neste momento o inserto já estava pronto para ligar com o vetor pGR.
Figura 16 Digestão tripla do pCR4 TOPO TA sequencing vector com o inserto de P35S mais 5’ do vírus, utilizando as enzimas AscI, KpnI e SspI. M: Marcador 1Kb Plus (Invitrogen); 1 e 2: clones não digeridos com as enzimas AscI, KpnI e SspI; 1’ e 2’: clones digeridos com as enzimas AscI, KpnI e SspI, resultando em fragmentos de 3938, 2788 e 1168 pb; L: Low DNA Mass.
Preparação do 3’ para ser inserido no vetor
Nesta etapa, o terminal 3’ já estava presente no vetor pCR4 TOPO TA sequencing vector (Invitrogen) e para não ter que realizar uma digestão tripla com foi realizado no procedimento com o 5’ e para ao mesmo tempo inserir um sítio de restrição para a enzima PacI, foi necessário realizar uma PCR com o fragmento P15340, que vai aproximadamente da base 3530 até o terminal 3’ resultando em um fragmento de 3062 pb. Logo depois se realizou uma digestão dupla com as enzimas KpnI e PacI. O resultado esperado desta digestão foi aplicado em gel de agarose para purificação de banda, mostrando a presença de duas bandas, sendo a maior, de aproximadamente 3062 pb, o P15340 e a menor são as extremidades perdidas após a digestão (Figura 18). Após uma purificação por eluição de banda o fragmento já estava pronto para se ligar ao vetor pGR (Figura 17).
Figura 17 Digestão do 3’ do CSDaV com as enzimas KpnI e PacI. M: Marcador 1Kb Plus (Invitrogen);1ao 9: digestão do 3’ com as enzimas PacI e KpnI.
2. Desenvolvimento de vetor para clonagem e inserção do genoma completo de CSDaV
Analisando o genoma do CSDaV, observou-se que este possui o sítio de restrição para PacI na extremidade 3’, o sítio para enzima de restrição KpnI no meio do genoma e que o promotor 35S, previamente fusionado a extremidade 5’, possui o sítio para enzima de restrição AscI.
Como o genoma do CSDaV foi anteriormente clonado sendo dividido ao meio, decidiu-se por modificar o vetor através da técnica de PCR para modificar o tamanho do vetor e inserir os sítios para as enzimas PacI e AscI, resultando em um vetor de aproximadamente 4000 pb. Já o sítio de restrição para a enzima KpnI foi inserido quando o vetor foi ligado ao sítio de clonagem do vetor pBluescript SKII+, previamente fosforilado, de aproximadamente 173 pb .
Pode se observar na figura 18 o resultado desta amplificação, mostrando no poço 1 o sítio de clonagem do vetor pBluescript SKII+ com aproximadamente 173 pb e no poço 2 a amplificação do vetor pGR com aproximadamente 4000 pb.
Figura 18 Amplificação do sítio de clonagem do vetor pBluescript SKII+ e vetor pGR. M: Marcador 1Kb Plus (Invitrogen); 1: sítio de clonagem do vetor pBluescript SKII+; 2: vetor pGR, L: Low DNA Mass.
Logo após a ligação do vetor ao sítio de clonagem do vetor pBluescript SKII+, selecionou-se o clone 2, que continha o vetor com os três sítios de restrição esperados (Figura 19) e digeriu-se o vetor pGR com as enzimas AscI e KpnI.
Figura 19 Digestão teste do vetor com sítio de restrição com as enzimas KnpI, AscI e PacI. M: Marcador 1Kb Plus (Invitrogen); 1: clone 1 não digerido; 2: clone 1 digerido com AscI; 3: clone 1 digerido com KpnI; 4: clone 1 digerido com PacI; 5: clone 2 não digerido;6: clone 2 digerido com AscI; 7: clone 2 digerido com KpnI; 8: clone 2 digerido com PacI.
Pensado nessa estratégia, decidiu-se por inserir primeiramente o terminal 5’ do CSDaV, previamente fusionado ao promotor 35S e por último o terminal 3’ ao vetor pGR. Uma transformação em bactérias E. coli por eletroporação (tópico 1.3.5) e extração de DNA plamidial (tópico 1.3.6) resultando em um fragmento de aproximadamente 8000 pb (Figura 20).
Figura 20 Extração de DNA plasmidial do vetor pGR com o terminal 5’ fusionado com promotor 35S. M: Marcador 1Kb Plus (Invitrogen) ; 1: vetor pGR com o terminal 5’ fusionado com promotor 35S; L: lambda 200.
Neste momento só faltava a outra metade do vírus ser inserida no vetor pGR para que o clone infeccioso estivesse completo. Para tal finalidade, primeiramente se fez necessário a digestão do vetor pGR com o 5’ do vírus com as enzimas de restrição KpnI e PacI. Logo após este foi desfoforilado e ligado ao terminal 3’ do CSDaV, previamente digerido com ambas as enzimas (tópico 1.4.2). É necessário a desfosforilação do vetor antes de ser ligado ao inserto porque mesmo que este possua extremidades diferentes após a digestão dupla, ainda corre o risco do vetor se fechar e não se ligar ao inserto.
Esta ligação utilizou a enzima T4 DNA ligase (NEB) e logo após, realizou-se uma transformação em bactérias E. coli por eletroporação (tópico 1.3.5) e extração de DNA plamidial (tópico 1.3.6) resultando em um fragmento de aproximadamente 12000 pb. Para se ter certeza quanto ao tamanho do vetor ligado ao genoma do CSDaV, realizou-e uma digestão teste com a enzima de restrição KpnI. Esta disgestão mostrou que os clones 2, 3 e 5 apresentaram o tamanho esperado de 12000 pb (Figura 21).
Figura 21 Digestão teste do clone infeccioso com o a enzima KpnI. M: Marcador 1Kb Plus (Invitrogen) ; 1, 2,3, 4 e 5: clones não digeridos com a enzima KpnI; 1’, 2’, 3’, 4’ e 5’: clones digeridos com a enzima KpnI, resultando em um fragmento de 12000 pb; P: digestão do lambda com PstI para ser utilizado como marcador.
Para confirmação de que o clone infeccioso tinha realmente sido concluído, realizou-se uma digestão teste com as enzimas de restrição AscI e PacI com os clones selecionados para que se separasse o vetor do inserto, resultando em duas bandas em gel de agarose, uma com aproximadamente 7000 pb, que é o CSDaV completo e outra com aproximadamente 4000 pb, que é o vetor pGR (Figura 22).
Figura 22 Digestão do clone infeccioso com as enzimas de restrição AscI e PacI. M: Marcador 1Kb Plus (Invitrogen); 2, 3 e 5: clones não digeridos com as enzimas AscI, PacI; 2’, 3’ e 5’: clones digeridos com as enzimas AscI e PacI, resultando em fragmentos de 7000 e 4000 pb.
Após a confirmação do mesmo com os clones 2 e 5, realizou-se uma transformação em Agrobacterium tumefaciens (cepa GV3101), o qual teve sua confirmação através de PCR de colônia utilizando os mesmos primers utilizados para amplificação do promotor 35S, P71 e P72 (tabela 1) (Figura 23). Desta confirmação foram escolhidos dois clones: o clone 9 da transformação do clone 2 em Agrobacterium tumefaciens e o clone 10 da transformação do clone 5 também em Agrobacterium tumefaciens. Estes foram induzidos em Nicotiana benthamiana, sendo que foram utilizadas três plantas, uma para um clone 9 e duas para o clone 10.
Figura 23 PCR de colônia dos clones em Agrobacterium
Tumefaciens. M: Marcador 1Kb Plus (Invitrogen); 1,2 e 3: produto
do PCR de colônia (aproximadamente 500 pb).
Com o objetivo de confirmar a tradução de genes virais, decidiu-se por realizar um Western Blot das folhas infiltradas e superiores a estas utilizando um anticorpo policlonal contra este vírus (cedido pelo Fundeciturs, imunizado pela preparação semi- purificada) o qual não teve resultado satisfatório. Deveria aparecer duas bandas, uma de 21 e outra de 24 KDa, que corresponderiam as proteínas do capsídeo, como foi demonstrado no trabalho de Maccheroni et al. (2005). Porém estas proteínas não foram visíveis tanto nas amostras de folhas infiltradas como na amostra do CSDaV semi- purificada de planta infectada utilizado como controle positivo (Figura 24).
Figura 24 Western Blot do clone infeccioso. M: marcador de massa molecular Page Rule (Fermentas); 1 ao 5: amostras de folhas infiltradas com o clone infeccioso; (-): controle negativo (planta não infiltrada) ; (+): controle positivo (tecido infectado com CSDaV).
De acordo com Maccheroni et al., (2005) a concentração de partículas virais era muito baixa em folhas de laranjeiras para uma possível detecção do vírus em tecidos vegetais por microscopia eletrônica. Sendo necessária a purificação das partículas virais de folhas sintomáticas de acordo com a metodologia descrita por Bar-Joseph et. al., (1985). Este trabalho mostrou a presença de partículas virais isométricas de cerca de 30 nm de diâmetro, com um contorno arredondado e estrutura superficial proeminente. À semelhança de outros Marafivirus, CSDaV mostrou a presença de dois tipos de partículas: uma aparentemente penetrou através da coloração negativa (forma de T, que é semelhante à casca vazia de Tymoviridae não-infecciosa) e partículas intactas.
No presente trabalho, ao se analisar por microscopia eletrônica de secção ultrafina as folhas inoculada e superiores a estas, observou-se a presença de possíveis partículas esféricas semelhantes à descrita no trabalho de Maccheroni et. al. (2005) e semelhante às características descritas pela família Tymoviridae, que se descreve como virions isométricos, não envelopados, 30nm de diâmetro, contorno arredondado (Martelli et. al., 2002) (Figura 25). Provavelmente estas partículas demonstram a presença de CSDaV nas plantas inoculadas com o clone infeccioso, porém uma confirmação mais precisa está em andamento.
Figura 25 Possível partícula viral observada por microscopia eletrônica.
PERSPECTIVAS
Ainda não se sabe se os resultados obtidos são causados pelo Citrus sudden death-associated virus (CSDaV) e nem se é ele o real causador da Morte Súbita do Citros. Para isso é necessário uma maior verificação como:
• Repetir o experimento de infiltração por Agrobacterium tumefaciens com um número maior de plantas Nicotiana benthamiana para uma concentração de partículas virais para realizar o gel de poliacrilamida, Western Blot e Microscopia Eletrônica.
• Utilizar outro anticorpo primário, que está sendo confeccionado pela Fundecitrus, produzido através da preparação semi-purificada do CSDaV para a realização do Western Blot.
• Realizar Northern Blot para confirmar a recuperação de vírus através da técnica. • Infiltrar o clone infeccioso em laranjeiras enxertadas em limoeiro cravo e
enxertadas em tangerineiras Cleópatra para verificação do CSDaV no seu real hospedeiro, quanto a sintomas tanto em laranjeiras suscetíveis quanto resistentes.
Somente após todos esses procedimentos poderá ter certeza se o CSDaV é realmente recuperado pela técnica, e supostamente o causador do MSC, pois depois de ter examinado todos estes procedimentos se terá certeza que o vírus passou por todos os postulados de Koch. Este consiste em inocular o suposto agente causador da doença em organismos sadios, nesse caso as laranjeiras, e verificar se elas contraem ou não a enfermidade. É um trabalho demorado, pois período de incubação pode chegar a dois anos e só quando aparecem os primeiros sintomas como a perda de brilho das folhas e o bloqueio dos vasos que conduzem a seiva da copa para as raízes e a morte destas é que se saberá que se recuperou o vírus.
Definidas estas etapas também se solucionará a duvida se o CSDaV é uma estirpe mais virulenta do CTV, ou se ele está em associação com o CTV ou se simplesmente ele é o causador do MSC.
Com os resultados atuais ainda é muito difícil de definir isso, pois dentro de uma mesma planta pode existir várias estirpes de vírus diferentes e se definir qual é o real vírus causador da doença precisa de muito estudo. Por isso só o seqüenciamento dos
organismos presentes em plantas com sintomas não é suficiente para indicar qual é o vírus.
Por outro lado, mesmo que o organismo, no caso as laranjeiras, demonstrem sintomas parecidos com uma doença causada por um vírus conhecido, também não é suficiente para indicar se esta doença nova é causada por esse vírus conhecido, ou seja, uma estirpe mutante do mesmo, já que, no caso das laranjeiras, mesmo os pés sadios, apresentam um complexo de vírus mutados da tristeza, que se tornou endêmica no país.
Trabalhos anteriores indicam que interações sinérgicas entre vírus de plantas pode levar a um aumento da gravidade dos sintomas e/ou acumulação de vírus em algumas plantas hospedeiras. Em alguns casos, supressores de silenciamento ligados a estas viroses mediam estas sinergias intervirais (Seo et. al., 2008). Esta também é uma possibilidade que também precisa de mais averiguações.
Ao que se sabe atualmente, logo após estes surtos de MSC causados entre o ano de 1999 e 2005, não se tem ouvido falar do MSC e provavelmente os agricultores tentaram substituir os porta-enxertos suscetíveis por resistentes. Por outro lado, ate o surgimento do MSC, os pés de laranjeiras eram muito velhos e após a sua perda com esta doença, muitos desses tiveram que ser plantados novamente, acarretando um prejuízo imenso. Estudos indicam que as laranjeiras demonstraram seus sintomas com mais de 22 meses de idade, isso é com plantas adultas, mostrando que mesmo que se tenha conseguido medidas profiláticas para se evitar a disseminação dessa doença, se deve continuar os estudos para se descobrir qual é o causador da mesma, pois esta pode voltar a surgir quando os pés de laranja estiverem maiores, já que, nem todos os pés de laranja tiveram seus porta-enxertos substituídos e estudos anteriores indicam que a subenxertia pode amenizar os sintomas mas é uma técnica cara e interenxertia não teve resultado satisfatório (Pompeu Junior & Blumer, 2008).
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