Structured public deliberation

As patas (coxim plantar direito) de dois camundongos diferentes por grupo de tratamento foram submetidas à dissecção asséptica. Depois as mesmas foram trituradas em meio de cultura líquida Schneider (Sigma®) acrescido de 10% de soro fetal bovino e 0,2% de gentamicina. Posteriormente esse material foi cultivado em placas tipo ELISA em sucessivas diluições de 10 vezes e incubado por até 72 horas em estufa tipo BOD a 26o C. Caso houvesse uma amastigota em cada poço, cresceriam formas promastigotas após o período de incubação e a leitura para observar a presença (+) ou ausência (-) dessas formas em cada poço era feita em microscópio de luz invertida com objetiva de aumento 40 vezes. O número de parasitos por pata foi analisado através do programa ELIDA® (TITUS et al., 1985; TASWELL, 1987).

5 RESULTADOS

5.1 Determinação das curvas padrão de crescimento:

Nas curvas realizadas (em triplicata) as promastigotas de L. amazonensis apresentaram fase logarítmica de crescimento até o sexto dia e a partir deste iniciou-se a fase estacionária (GRÁFICO 1). Escolheu-se o sexto dia de crescimento como o dia padrão de uso da cepa, tanto para os estudos in vitro, quanto para os estudos in vivo realizados posteriormente.

No caso das promastigotas de L. braziliensis observou-se que a fase logarítmica de crescimento foi até o quinto dia e a partir deste iniciou-se a fase estacionária (GRÁFICO 2). Nos testes in vitro escolheu-se o quinto dia como o padrão para utilização dessa cepa nos futuros experimentos.

Finalmente, as promastigotas de L. guyanensis apresentaram fase logarítmica de crescimento até o sexto dia e a partir deste iniciou-se a fase estacionária (GRÁFICO 3). Nos testes in vitro o sexto dia foi escolhido como o padrão para essa espécie.

Gráfico 1- Distribuição das médias do número de promastigotas/mL de Leishmania (Leishmania) amazonensis contadas segundo o tempo de crescimento das culturas (dias). As barras representam duas vezes o erro padrão. Letras iguais indicam que não há diferença estatística entre os dias. A seta indica o dia escolhido para realização dos experimentos.

Gráfico 2- Distribuição das médias do número de promastigotas/mL de Leishmania (Viannia) braziliensis contadas segundo o tempo de crescimento das culturas (dias). As barras representam duas vezes o erro padrão. Letras iguais indicam que não há diferença estatística entre os dias. A seta indica o dia escolhido para realização dos experimentos.

Gráfico 3- Distribuição das médias do número de promastigotas/mL de Leishmania (Viannia) guyanensis contadas segundo o tempo de crescimento das culturas (dias). As barras representam duas vezes o erro padrão. Letras iguais indicam que não há diferença estatística entre os dias. A seta indica o dia escolhido para realização dos experimentos.

5.2 Ação leishmanicida in vitro da miltefosine sobre as formas promastigotas de

Leishmania:

A miltefosine (M) e a N-metil glucamina (G) foram avaliadas quanto as suas atividades leishmanicidas contra promastigotas de L. amazonensis, L. braziliensis e L. guyanensis através do cálculo do IC50 (TABELA 1).

Tabela 1: Atividade leishmanicida in vitro da miltefosine e N-metil glucamina contra formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Viannia) guyanensis

Miltefosine N-metil glucamina Promastigotas IC50 (μg/ml) IC50 (μg/ml)

Leishmania (L.) amazonensis 12,2 300 (0,6-216,5) (120,3-400,3) Leishmania (V.) braziliensis 22,9 122,3 (9,7-53,9) (87,5-150,9) Leishmania (L.) guyanensis 271,7 3.919 (111,8-660,6) (360,2-4.263)

Os resultados representam a média de experimentos realizados em triplicata com intervalo de confiança de 95%.

Contra as promastigotas de L. amazonensis a avaliação da atividade leishmanicida de M pelo MTT demonstrou valor de IC50 igual a 12,2 μg/ml (GRÁFICO 5).

Gráfico 5 - Curva da viabilidade celular de Leishmania (Leishmania) amazonensis determinada pelo ensaio de redução do MTT (% promastigotas viáveis) após incubação por 48 horas com diferentes concentrações (100 a 3,1μg/mL) de miltefosine (M). As barras indicam o erro padrão da média. M1= 100μg/mL; M2= 50μg/mL; M3=25μg/mL; M4= 12,5μg/mL; M5=6,7μg/mL; M6=3,1μg/mL.

Contra as promastigotas de L. amazonensis a avaliação da atividade leishmanicida de G pelo MTT demonstrou valor de IC50 a igual a 300 μg/ml (GRÁFICO 6).

Gráfico 6 - Curva da viabilidade celular de Leishmania (Leishmania) amazonensis determinada pelo ensaio de redução do MTT (% promastigotas viáveis) após incubação por 48 horas com diferentes concentrações (300 a 9,3μg/mL) de N-metil glucamina (G). As barras indicam o erro padrão da média. G1=300μg/mL; G2=150μg/mL; G3=75μg/mL; G4=37,5 μg/mL; G5=18,7μg/mL; G6= 9,3μg/mL.

No grupo M+G as concentrações 12,5+37,5μg/mL foram as que mais diminuíram a viabilidade celular das promastigotas de L. amazonensis (GRÁFICO 7).

Gráfico 7 - Distribuição da viabilidade celular de Leishmania (Leishmania) amazonensis determinada pelo ensaio de redução do MTT (% promastigotas viáveis) após incubação por 48 horas com diferentes concentrações de miltefosine (M), N-metil glucamina (G) e M+G. As barras indicam o erro padrão da média. MG1=100+300μg/mL; MG2=50+150μg/mL; MG3=25+75μg/mL; MG4=12,5+37,5μg/mL; MG5=6,7+18,7μg/mL; MG6=3,1+9,3μg/mL.

Contra as promastigotas de L. braziliensis a avaliação da atividade leishmanicida de M pelo MTT demonstrou valor de IC50 igual a 22,9 μg/ml (GRÁFICO 8).

Gráfico 8 - Curva da viabilidade celular de Leishmania (Viannia) braziliensis determinada pelo ensaio de redução do MTT (% promastigotas viáveis) após incubação por 48 horas com diferentes concentrações (100 a 3,1μg/mL) de miltefosine (M). As barras indicam o erro padrão da média. M1=100μg/mL; M2=50μg/mL; M3=25μg/mL; M4=12,5μg/mL; M5=6,7μg/mL; M6= 3,1μg/mL.

A G demonstrou valor de IC50 igual a 122,3 μg/ml contra as promastigotas de L. braziliensis (GRÁFICO 9).

Gráfico 9 - Curva da viabilidade celular de Leishmania (Viannia) braziliensis determinada pelo ensaio de redução do MTT (% promastigotas viáveis) após incubação por 48 horas com diferentes concentrações (300 a 9,3μg/mL) de N-metil glucamina(G). As barras indicam o erro padrão da média. G1=300μg/mL; G2=150μg/mL; G3=75μg/mL; G4=37,5μg/mL; G5=18,7 μg/mL; G6= 9,3μg/mL.

No grupo M+G as concentrações 100+300μg/mL foram as que mais diminuíram a viabilidade celular das promastigotas de L. braziliensis (GRÁFICO 10).

Gráfico 10 - Distribuição da viabilidade celular de Leishmania (Viannia) braziliensis determinada pelo ensaio de redução do MTT (% promastigotas viáveis) após incubação por 48 horas com diferentes concentrações de miltefosine (M), N-metil glucamina (G) e M+G. As barras indicam o erro padrão da média. MG1=100+300μg/mL; MG2=50+150μg/mL; MG3=25+75μg/mL; MG4=12,5+37,5μg/mL; MG5=6,7+18,7μg/mL; MG6=3,1+9,3μg/mL.

No caso das promastigotas de L. guyanensis a atividade leishmanicida da miltefosine pelo MTT demonstrou valor de IC50 igual a 271,7 μg/ml (GR’AFICO 11).

Gráfico 11 - Curva da viabilidade celular de Leishmania (Viannia) guyanensis determinada pelo ensaio de redução do MTT (% promastigotas viáveis) após incubação por 48 horas com diferentes concentrações (100 a 3,1μg/mL) de miltefosine (M). As barras indicam o erro padrão da média. M1=100μg/mL; M2=50μg/mL; M3= 25μg/mL; M4=2,5μg/mL; M5=6,7μg/mL; M6= 3,1μg/mL.

No caso das promastigotas de L. guyanensis a atividade leishmanicida da G demonstrou valor de IC50 igual a 3.919,0 μg/ml (GRÁFICO 12).

Gráfico 12 - Curva da viabilidade celular de Leishmania (Viannia) guyanensis determinada pelo ensaio de redução do MTT (% promastigotas viáveis) após incubação por 48 horas com diferentes concentrações (300 a 9,3μg/mL) de N-metil glucamina (G). As barras indicam o erro padrão da média. G1=300μg/mL; G2=150μg/mL; G3=75μg/mL; G4=37,5μg/mL; G5=18,7 μg/mL; G6= 9,3μg/mL.

No grupo M+G as concentrações 100+300μg/mL foram as que mais diminuíram a viabilidade celular das promastigotas de L. guyanensis (GRÁFICO 13).

Gráfico 13 - Distribuição da viabilidade celular de Leishmania (Viannia) guyanensis determinada pelo ensaio de redução do MTT (% promastigotas viáveis) após incubação por 48 horas com diferentes concentrações de miltefosine (M), N-metil glucamina (G) e N+G. As barras indicam o erro padrão da média. MG=100+300μg/mL; MG2= 50+150μg/mL; MG3=25+75μg/mL; MG4=12,5+37,5μg/mL; MG5=6,7+18,7μg/mL; MG6=3,1+9,3μg/mL.

5.3 Estudo comparativo entre a miltefosine, N-metil glucamina e a associação da miltefosine com N-metil glucamina no tratamento de leishmaniose cutânea experimental:

5.3.1 Avaliação da eficácia dos tratamentos:

5.3.1.1 Medição da lesão cutânea (diâmetro das patas):

No grupo M (GRÁFICO 14) a média dos diâmetros das patas caiu de 2,1 (pré- tratamento) para 1,7 (pós-tratamento), com significância estatística (p:0,004). No grupo G (GRÁFICO 15) a média dos diâmetros das patas não apresentou diferença estatística no pré e pós-tratamento (p: 0,407). No grupo M+G (GRÁFICO 16) também não houve diferença estatística (p:0,923). A média do grupo C (GRÁFICO 17) cresceu de 1,9 para 2,2 (p: 0,001).

Gráfico 14 - Distribuição do diâmetro (mm) das patas dos camundongos do grupo miltefosine (M) no pré-tratamento e após tratamento com miltefosine dose de 20mg/kg/dia, via oral, durante 10 dias.

Gráfico 15 - Distribuição do diâmetro (mm) das patas dos camundongos do grupo N-metil glucamina (G) no pré-tratamento e após tratamento com N-metil glucamina dose de 400mg Sb+5/Kg/dia via intramuscular, durante 10 dias.

Gráfico 16 - Distribuição do diâmetro (mm) das patas dos camundongos do grupo miltefosine + N- metil glucamina (M+G) no pré-tratamento e após tratamento com miltefosine dose de 20mg/kg/dia via oral e N-metil glucamina dose de 400mg Sb+5/Kg/dia via intramuscular, durante 10 dias.

Gráfico 17 - Distribuição do diâmetro (mm) das patas dos camundongos do grupo controle (C) sem tratamento.

No pré-tratamento, quando se comparou a distribuição do diâmetro das patas entre os grupos (GRÁFICO 18) observou-se que o único com diferença estatística significante em relação aos outros grupos foi o M+G. No pós-tratamento essa diferença aumentou (GRÁFICO 19) sendo observadas diferenças estatísticas significantes entre os três grupos: C, M e M+G.

Gráfico 18 - Distribuição do diâmetro (mm) das patas dos camundongos dos grupos miltefosine (M), N- metil glucamina (G), miltefosine+N-metil glucamina (M+G) e controle (C) no pré-tratamento. Letras diferentes indicam diferença estatística. As barras de erro representam duas vezes o erro padrão.

Gráfico 19 - Distribuição do diâmetro (mm) das patas dos camundongos dos grupos miltefosine (M), N-metil glucamina (G), miltefosine+N-metil glucamina (M+G) e controle (C) no pós-tratamento. Letras diferentes indicam diferença estatística. As barras de erro representam duas vezes o erro padrão. M=grupo tratado com miltefosine na dose de 20mg/kg/dia, via oral, durante 10 dias. G=grupo tratado com N-metil-glucamina na dose de 400mg Sb+5/Kg/dia via intramuscular, durante 10 dias. M+G= grupo tratado com a associação da miltefosine e N-metil-glucamina nas mesmas dosagens, vias de administrações e tempo anteriores. C=grupo controle sem tratamento.

5.3.1.2 Exames parasitológicos:

5.3.1.2.1 Culturas e esfregaços:

Nas culturas (TABELA 2 e GRÁFICO 20) o grupo M obteve 50% de culturas negativas após o tratamento. O grupo M+G obteve 27,8%. O grupo G se igualou ao grupo C com 11,1%. No total foram realizadas 64 culturas, sendo 46 positivas (71,9%) e 18 negativas (28,1%).

Nos esfregaços (TABELA 3 e GRÁFICO 21) o grupo M obteve 38,5% e o grupo M+G obteve 42,3% de esfregaços negativos. O grupo G veio em seguida com 15,4% e o grupo C com 3,8%. Num total de 64 esfregaços, 38 foram positivos (59,4%) e 26 negativos (40,6%).

Tabela 2: Resultado das culturas de Leishmania feitas a partir da linfa das patas dos camundongos após tratamento com miltefosine na dose de 20mg/kg/dia, via oral, durante 10 dias, N-metil-glucamina na dose de 400mg Sb+5/Kg/dia via intramuscular, durante 10 dias, associação da miltefosine e N-metil- glucamina nas mesmas dosagens, vias de administrações e tempo anteriores e controle sem tratamento.

Grupos Total Controle Miltefosine N-metil

glucamina Miltefosine + N-metil glucamina Negativa n Cultura % Positiva n % 2 11,1% 14 30,4% 9 50,0% 7 15,2% 2 11,1% 14 30,4% 5 27,8% 11 23,9% 18 100% 46 100% Total n % 16 25% 16 25% 16 25% 16 25% 64 100% P: 0,017

Tabela 3: Resultado da pesquisa de amastigotas nos esfregaços feitos a partir da linfa das patas dos camundongos após tratamento com miltefosine na dose de 20mg/kg/dia, via oral, durante 10 dias, N- metil-glucamina na dose de 400mg Sb+5/Kg/dia via intramuscular, durante 10 dias, associação da miltefosine e N-metil-glucamina nas mesmas dosagens, vias de administrações e tempo anteriores e controle sem tratamento.

Grupos Total Controle Miltefosine N-metil

glucamina Miltefosine + N-metil glucamina Negativo n Esfregaço % Positivo n % 1 3,8% 15 39,5% 10 38,5% 6 15,8% 4 15,4% 12 31,6% 11 42,3% 5 13,2% 26 100% 38 100% Total n % 16 25% 16 25% 16 25% 16 25% 64 100% P: 0,000

Gráfico 20 - Distribuição da porcentagem de culturas negativas e positivas feitas a partir da linfa das patas dos camundongos após tratamento com miltefosine na dose de 20mg/kg/dia, via oral, durante 10 dias, N- metil-glucamina na dose de 400mg Sb+5/Kg/dia via intramuscular, durante 10 dias, associação da miltefosine e N-metil-glucamina nas mesmas dosagens, vias de administrações e tempo anteriores e controle sem tratamento.

Gráfico 21- Distribuição da porcentagem de esfregaços negativos e positivos feitos a partir da linfa das patas dos camundongos após tratamento com miltefosine na dose de 20mg/kg/dia, via oral, durante 10 dias, N-metil-glucamina na dose de 400mg Sb+5/Kg/dia via intramuscular, durante 10 dias, associação da miltefosine e N-metil-glucamina nas mesmas dosagens, vias de administrações e tempo anteriores e controle sem tratamento.

5.3.1.2.2 Diluição limitante:

O número de formas amastigotas por pata de camundongo, estipuladas a partir do programa ELIDA® nos grupos M e M+G foi nulo, no grupo C foi de 6,9 x 105 parasitos/mL, no grupo G foi de 1,8 x 105 parasitos/mL (GRÁFICO 22).

Gráfico 22 – Número de parasitos por pata de camundongos C57BL/6 infectados com Leishmania (Leishmania) amazonensis após tratamento com miltefosine na dose de 20mg/kg/dia, via oral, durante 10 dias, N-metil-glucamina na dose de 400mg Sb+5/Kg/dia via intramuscular, durante 10 dias, associação da miltefosine e N-metil-glucamina nas mesmas dosagens, vias de administrações e tempo anteriores e controle sem tratamento.

6 DISCUSSÃO