Structural determinants for the prescription of LLDs in Norway

Em relação à biometria testicular (tabela 2), percebeu-se que as variáveis quantitativas avaliadas, comprimento, altura, largura, e volume dos testículos direito e esquerdo não tiveram diferenças entre as estações (P>0,05). Robalo Silva (2007), em pesquisa com garanhões da raça Lusitano, em alta latitude (39°12´ao Norte) observou variabilidade sazonal e entre garanhões em relação às dimensões testiculares. Estudando jumentos da raça Martina, Carluccio et al. (2013) observaram que nas condições experimentais impostas, à latitude de 42°42´, a morfometria testicular não sofreu alterações estacionais. Os dados desses experimentos levantam a possibilidade da influência de outros fatores, não só a duração do fotoperíodo, nas medidas testiculares ao longo do ano. No presente estudo, pode-se mostrar que sob essas determinadas condições geográficas e de manejo, os garanhões da raça Mangalarga Marchador não apresentaram diferenças nas biometrias testiculares durante as estações avaliadas.

.

Tabela 02:Valores médios e desvio padrão da biometria testicular de garanhões da

raça Mangalarga Marchador fora da estação reprodutiva (tratamento) e na estação de monta (tratamento 2)

Características Tratamento 1 (n=11) Tratamento 2 (n=8)

CONSTD 2,0 ± 0,1 2,0 ±0,0 CTD (mm) 98,0 ±3,3 100,2 ±5,0 LTD (mm) 57,1 ±1,5 54,1 ±2,0 ATD (mm) 74,0 ±2,6 72,5 ±2,5 VTD (mm³) 222139,9 ±18634,7 207588,2 ±17740,5 CONSTE 2,0 ±0,1 2,0 ±0,0 CTE (mm) 100,9 ±4,3 100,5 ±4,5 LTE (mm) 61,2 ±2,2 62,7 ±3,2 ATE (mm) 73,4 ±2,8 75,7 ±3,8 VTE (mm³) 245167,9 ±22386,9 259705,8 ±35519,5 VTT (mm³) 233653,9 ±19166,3 233647,0 ±24708,0 P > 0.05, ANOVA.

Consistência, comprimento, largura, altura e volume do testículo direito (CONSTD, CTD, ATD,VTD); consistência, comprimento, largura, altura e volume do testículo esquerdo (CONSTE, CTE, ATE,

Todos os animais utilizados neste estudo apresentaram consistência testicular normal e biometrias constantes durante os dois períodos avaliados (Tabela 02). A determinação da dimensão e da consistência testicular deve ser sistematicamente associada à avaliação das características seminais nos exames de avaliação do potencial reprodutivo de cada garanhão (ROBALO SILVA, 2007), visto que, o tamanho e volume testiculares são medidas diretas da quantidade de parênquima presente no tecido (THOMPSON et al., 1979), considerando-se também que é possível de predizer a produção espermática a partir do volume testicular.

Com relação aos parâmetros seminais avaliados, volume, aspecto, motilidade, vigor, concentração e supra-vital, os resultados obtidos não apresentaram diferenças entre as estações do ano (P>0,05) (Tabela 03). Na literatura há citações de variações desses dados ao longo do ano, havendo registros de maiores volumes na primavera e menores no inverno (JANETT et al., 2003b; ROBALO SILVA et al., 2007), volumes máximos no verão e mínimos no inverno (JANETT et al., 2003a) ou máximos no verão e mínimos na primavera (PICKETT et al., 1976). Freitas (2010), avaliando garanhões da raça Mangalarga Marchador em região de clima tropical, a 20o 45’20’’ de latitude sul, encontrou diferenças sazonais, tanto o volume médio total quanto o volume médio desprovido da fração gel aumentaram progressivamente entre o verão e o outono (30,2 a 73,1 mL e 35,8 a 115,4 mL, respectivamente). Essas diferenças podem ser explicadas em função das diferentes raças estudadas, freqüência na coleta de sêmen e principalmente pela latitude e pelo clima, que parece influenciar o comportamento sexual dos reprodutores e a proporção de gel nos ejaculados (ROBALO SILVA et al., 2007).

Tabela 03:Média e desvio padrão dos parâmetros seminais de garanhões da raça

Mangalarga Marchador na estação não reprodutiva (tratamento 1) e na estação de monta (tratamento 2)

VARIÁVEIS TRATAMENTO 1 (n=11) TRATAMENTO 2 (n=8)

Volume (mL) 49,8 ± 4,7 59,6 ± 5,6 Aspecto 2,6 ± 0,1 2,6 ± 0,1 Motilidade (%) 74,3 ± 1,7 73,4 ± 1,9 Vigor (1-5) 3,0 ± 0,1 3,0 ± 0,2 Concentração(106/mL) 163,0 ± 11,5 136,9 ± 10,5 Supra Vital (%) 78,9 ± 2,1 73,8 ± 1,8 P > 0.05, ANOVA.

Durante as avaliações microscópicas do sêmen fora da estação reprodutiva e dentro dela, Silva et al. (2007) observaram valores de motilidade total (MT) e progressiva (MP), respectivamente, 76,67±5,59; 66,67±5,59; 83,89±5,46; 75,56±6,35 para o sêmen in natura, logo, os valores de MT e MP dos espermatozóides no verão foram superiores àqueles observados no inverno. Da mesma forma, no mesmo trabalho, o vigor espermático do sêmen in natura apresentou-se superior nas amostras colhidas na estação reprodutiva (4,00 ±0,71) quando comparados àquelas colhidas na estação não reprodutiva (3,39 ±0,42). É importante ressaltar, que o experimento citado foi realizado a 8°01´18´´ de latitude Sul, ou seja, a diferença entre duração do fotoperíodo entre as estações é muito pequena, o que leva a pensar na interação de outros fatores climáticos na influência da reprodução equina e na variação individual de garanhões.

Freitas (2010) obteve valores superiores de motilidade espermática durante as estações de outono e inverno, assim como Pacheco (2002) em experimento conduzido na região sudeste do Brasil. Pickett et al. (1976) e Leme (2003) não observaram diferenças estacionais na motilidade espermática. Esses autores relataram que as diferenças estacionais na motilidade espermática podem ser influenciadas pelo manejo dos animais, freqüência na colheita de sêmen e condições ambientais, como temperatura e umidade. Ainda, o número de animais e a idade dos mesmos devem ser considerados (DOWSETT; KNOTT, 1996).

Conforme exposto na Tabela 03, os valores médios obtidos nas duas estações para o volume total do ejaculado, vigor e concentração espermática foram semelhantes aos resultados apresentados por Oliveira (2014) trabalhando com garanhões da raça Mangalarga Marchador (61,3mL; 3,4 e 159,4 x 106 espermatozóides/mL, respectivamente) Da mesma forma, as médias de motilidade espermática total e integridade da membrana espermática, avaliada pelo teste supra-vital, foram também semelhantes aos obtidos pelo mesmo pesquisador (73,94 e 72,8, respectivamente). Os valores médios de motilidade espermática total também foram semelhantes aos descritos para raças como Thoroughbreed, Shetland, Appalosa, Ponei, Palomino e Quarto de Milha que foram respectivamente, 71, 70, 73, 70, 74 %. Foram inferiores aos valores médios descritos para as raças Árabe e Standardbreed, respectivamente, 85 e 79 % (DOWSETT e KNOTT, 1996).

As características de tempo de reação, tempo de latência, tempo de monta e número de montas não apresentaram diferenças entre os períodos estudados (P>0,05) (Tabela 04).

Tabela 04: Médias e desvios padrão dos parâmetros comportamentais no

momento pré-cópula observados nos períodos fora da estação reprodutiva (tratamento 1) e durante a estação de monta (tratamento 2)

VARIÁVEIS TRATAMENTO 1 TRATAMENTO 2

TR 48.7 ± 10.5 32.2 ± 7.3 TL 74.7 ± 13.7 60.9 ± 10.5 TM 96.0 ± 15.5 87.8 ± 9.1 RF 0.5 ± 0.2 0.4 ± 0.2 NM 1.1 ± 0.1 1.1 ± 0.1 P > 0.05, ANOVA.

TR = Tempo de Reação, TL= Tempo de latência, TM = Tempo de monta, RF = número de reflexos de flehmen, NM = número de montas.

Thompson et al. (1977) trabalhando com garanhões submetidos ao tratamento com luz artificial, simulando o aumento natural do fotoperíodo em uma região de latitude 40°35´ ao norte, também não verificaram alterações em relação ao número de montas. No entanto, o tempo de reação foi menor nos animais que foram submetidos à luz. Isso já havia sido relatado por Skinner e Bowen (1968) e Pickett et al. (1970,1976) em que a média do tempo de reação tende a ser a maior durante o inverno e a menor durante a estação de monta natural. Talvez, a menor latitude em que foi realizado o presente estudo, com pouca diferença entre a duração do fotoperíodo durante as estações, não foi possível de perceber esta diferença de comportamento dos garanhões.

Os valores obtidos para o comportamento neste experimento foram inferiores aos observados por Oliveira (2014), que trabalhou com 110 garanhões da raça Mangalarga Marchador, em que as médias para tempo de reação, tempo de latência, tempo de monta, número de reflexos de flehmen e número de montas foram 101,1s; 28,1s; 32,8s; 0,9; 1,6, respectivamente. Isso pode ser observado na tabela 04. Percebe-se então, que neste estudo, a duração da colheita de sêmen foi menor do que o verificado para a raça Mangalarga Marchador por Oliveira (2014). O número de colheitas de sêmen e de garanhões trabalhados pode explicar a diferença dos resultados.

Nett (1993) sugere que, para a dosagem de hormônios do eixo hipotalâmico- hipofisário-testicular, as colheitas de sangue devem ser realizadas num período mínimo de seis a oito horas e em intervalos de 30 minutos, visto que a avaliação de uma única amostra pode estimar concentrações de três a quatro vezes diferentes. Como observado na tabela 05, os picos de testosterona observados nos dois tratamentos, são superiores aos valores de referência determinados para garanhões segundo Nachreiner e Hyland (1993) (200-1000pg/ml), trabalhando com animais puro sangue inglês em única colheita no dia. Isso explica a necessidade da colheita de amostra sanguínea em vários momentos do dia, já que a maioria dos estudos avaliando a concentração dos hormônios esteróides se baseia em uma colheita no dia. Além disso, deve-se levar em conta a metodologia de análise hormonal utilizada, uma vez que os trabalhos relacionados a dosagem de hormônios esteróides são embasados na análise por radioimunoensaio (RIA) e neste estudo, determinamos os valores pelas análises da quimioluminescência.

Os animais neste experimento não apresentaram comportamento sazonal quanto às concentrações séricas de testosterona. Corroborando com Pacheco (2002), trabalhando com cinco animais da raça Puro Sangue Árabe, em pesquisa realizada na região sudeste do país (~ 22 o S) em que as concentrações médias de testosterona, obtidas de colheita única de sangue durante a manhã, ao longo das estações do ano não apresentaram variações nas estações climáticas.

A influência do fotoperíodo na secreção de testosterona tem sido relatada na literatura (BERNDTSON et al., 1974; HARRIS et al., 1982; JOHNSON; THOMPSON, 1983; COX et al., 1988; ROSER; HUGHES, 1992; HOFFMANN e LANDECK, 1999; PACHECO, 2002; LEME, 2003), o que indica que, normalmente, as maiores concentrações desse hormônio são observadas durante o período de maior luminosidade. No entanto, a maioria dessas pesquisas são realizadas em regiões de clima temperado, em que devido às altas latitudes, as estações climáticas são muito bem marcadas, caracterizadas por uma maior diferença entre o comprimento do dia durante o ano. Nas regiões tropicais, como as estudadas neste experimento, as estações climáticas são menos definidas e os meses de inverno não são necessariamente impróprios para a reprodução dos machos equinos, o que reflete em menores mudanças da luminosidade ao longo do ano, o que pode não ser suficiente para a sinalização da luminosidade. Segundo Bronson e Heideman (1994), o fotoperíodo não parece ser muito confiável para a regulação

efeito da diferença de luminosidade entre estações, mesmo que pequena, é observado nas fêmeas equinas, que entram em anestro durante um período do ano.

Tabela 05:Picos e médias das concentrações de testosterona em garanhões da

raça Mangalarga Marchador avaliados fora da estação reprodutiva (Tratamento 1) e durante a estação de monta (Tratamento 2)

Tratamento 1 Tratamento 2 Pico de testosterona (pg/mL) 1676,4 ± 277,2 2451,1 ± 956,0 Concentração média de testosterona (pg/mL) 835,4 ± 32,2 854,5 ± 53,0 Concentração média de testosterona (pg/mL)* 752,4 ± 36,1 854,5 ± 53,0 P > 0.05. * 8 garanhões; pelo teste t.

Freitas (2010) não observou um padrão regular de secreção diária da testosterona, assim como pesquisa conduzida por Cox e Williams (1975). No mesmo estudo, a pesquisadora percebeu variação de secreção do hormônio entre animais e entre estações, em que as maiores concentrações foram observadas, de uma forma geral, entre 10:00 e 14:00h, mas outros picos de secreção ocorreram ao longo das 24 horas de colheita em todas as estações. Essa mesma inconstância em relação à secreção do hormônio foi proposto por Nett (1993), no entanto, obteve as maiores concentrações ao entardecer. De acordo com Pickett et al. (1989), as concentrações deste hormônio estão elevadas às 06:00 e 18:00h. Em estudo conduzido por Sharma (1976), as maiores concentrações de testosterona foram observadas nas colheitas realizadas às 08:00h, corroborando com Kirkpatrick et al. (1976), enquanto Ganjam e Kenney (1975) observaram que as maiores concentrações ocorriam às 06:00h. Como mostrado nas figuras 2 e 3, pode-se perceber que a distribuição dos valores de testosterona foi diferente dentro e fora da estação, apesar de não se observar diferença nas médias das concentrações. Ainda, as figuras mostram que as diferenças foram maiores nas colheitas pela manhã, em que as concentrações no período durante a estação de monta foram maiores do que fora da estação reprodutiva. Essa variação no perfil de secreção hormonal justifica, mais uma vez, a importância da metodologia empregada, colheita a cada 30 min, visto que a maioria dos estudos se baseia em amostras únicas, normalmente obtidas no período da manhã. A partir das figuras 2 e 3, pode-se pensar que a secreção de testosterona ocorreu de forma pulsátil e sem um comportamento definido entre os diferentes períodos de luminosidade. O que mais uma vez, confirma que uma única coleta de sangue durante o dia pode

levar a superestimação ou subestimação de resultados, o que provoca uma conclusão errônea em relação o status endócrino daquele animal.

Figura 02: Médias das concentrações de testosterona (pg/mL) em garanhões da

raça Mangalarga Marchador em cada sessão de colheita (Testosterona 1=Fora da estação reprodutiva /Testosterona 2=durante a estação de monta)

*Médias baseadas nos dados obtidos com os 11 garanhões

Figura 3: Valores da concentração sérica de testosterona (pg/mL) obtidos de

garanhões da raça Mangalarga Marchador em 25 colheitas intervaladas por 30 minutos durante 12h

Nos resultados deste estudo não se verificou relação da concentração de testosterona com volume do ejaculado, motilidade espermática, concentração espermática e integridade espermática (P>0,05). Pickett et al. (1976) verificaram baixa correlação entre as concentrações desse hormônio e parâmetros seminais. No entanto, no presente estudo, quando relacionado ao comportamento no momento pré-cópula, percebeu-se média correlação, do número de montas com as

0 500 1000 1500 2000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Coleta

Testosterona1Testosterona 1* testosterona2Testosterona 2

0 2000 4000 6000 8000 10000 testosterona testosterona2 Testosterona 1 Testosterona 2

testosterona são influenciadas pela estação e são maiores durante a estação reprodutiva (BERNDTSON, et al., 1974; THOMPSON,1977; KIRKPATRICK, 1977 CLAY, 1988). Esse fato, associado às mudanças de comportamento sazonais é consistente com a hipótese de que variações sazonais na libido e na espermatogênese são mediados, em parte, pela disponibilidade do andrógeno (PICKETT, 1992). Ainda, isso pode explicar os resultados verificados neste estudo, em que não se percebeu alterações sazonais do comportamento sexual no momento pré-cópula e das concentrações de testosterona.

Apesar de existir diferença significativa nas dosagens de testosterona entre animais (Tabela 07), não ocorreu diferença entre as estações. No entanto, ocorreu diferença entre a interação animal e estação, o que permite concluir que em alguns animais as concentrações médias do andrógeno apresentou comportamento sazonal, enquanto em outros animais, esse comportamento não foi observado, Thompson (1977), Thompson et al. (1985) e Pacheco (2002) não observaram alterações da interação animal e estação e entre animais, Freitas (2010) trabalhando com garanhões da mesma raça deste estudo, observou diferenças significativas.

Em relação aos resultados obtidos o que deve ser levado em consideração é que o fotoperíodo exerce importante influência nos mecanismos reprodutivos da espécie eqüina, mas ainda assim, as inter-relações entre o ambiente, a nutrição e a reprodução devem ser mais estudadas. Freitas (2010) observou altas correlações entre variáveis climáticas e características do sêmen fresco. Sabe-se que a variação do fotoperíodo das regiões estudadas é muito pequena, por isso talvez, os resultados observados. No entanto, deve-se atentar para outros fatores, visto que os efeitos do fotoperíodo podem ser modificados por temperatura, nutrição, condição corporal e idade (GRUBAUGH et al., 1982). Além disso, a escassez de literatura com metodologia semelhante, várias colheitas durante o dia para a dosagem de hormônios esteróides e análise pela quimioluminescência, dificulta a comparação entre os resultados.

Ainda, devem ser consideradas as diferenças entre as características reprodutivas dos machos e fêmeas sazonais de uma mesma espécie, o que pode estar relacionado a diferentes formas de regulação ambiental. O anestro sazonal das fêmeas foi observado claramente em todas regiões estudadas, tendo em vista que nas coletas durante a estação não reprodutiva (tratamento 1), foi necessária a indução das fêmeas ao estro para serem utilizadas como manequim.

Tabela 06: Correlação simples de Pearson dos parâmetros quantitativos de

biometria testicular e qualidade seminal e comportamento no momento pré-cópula com os picos e médias de testosterona em garanhões da raça Mangalarga Marchador

Pico testosterona Média testosterona

VTD(mm³) -0,08 0,11 VTE(mm³) -0,09 -0,12 Volume (mL) 0,25 0,01 Motilidade (%) 0,12 0,20 Concentração (106/mL) 0,13 0,35 SV(%) 0,04 0,37 TR (s) -0,02 0,33 TL (s) 0,03 0,34 TM (s) -0,01 0,27 RF -0,04 0,33 NM 0,23 0,56*

* P < 0.05; **VTD (Volume testicular direito), VTE(Volume testicular esquerdo), SV(supra-vital), TR(Tempo de Reação), TL (Tempo de latência), TM (Tempo de monta), RF (número de reflexos de flehmen), NM (número de montas).

Tabela 07: Médias e desvio-padrão da concentração de testosterona (pg/mL) por

garanhão da raça Mangalarga Marchador no período fora da estação reprodutiva (tratamento 1) e dentro da estação de monta (tratamento 2)

Garanhões Tratamento 1 Tratamento 2

1 1401,2 ±136,7 a1 788,3 ±63,0b2 2 966,2 ±44,0 a2 670,1 ±36,2 a23 3 813,5 ±59,4 a3 861,8 ±335,7 a2 4 404,9 ±28,2 a4 377,2 ±29,7 a3 5 407,4 ±18,0b4 980,2 ±32,6 a2 6 652,1 ±127,3 a34 910,1 ±88,5 a2 7 832,7 ±93,8b3 1559,9 ±146,0 a1 8 547,5 ±59,1 a34 688,1 ±57,7 a23

Valores seguidos por letras diferentes na linha diferem entre si (P < 0.05), valores seguidos por números diferentes na coluna diferem entre si (P < 0.05). Resultados obtidos pelo teste t.