2. Literature Review
2.7. Stakeholder Salience Theory
Retinóides são importante classe de substâncias para a prevenção e tratamento de diversos tipos de câncer, especialmente o de mama (PASTORINO et al., 1993; DRAGNEV; RIGAS; DMITROVSKY, 2000; MENARD et al., 2001; McDANIEL et al., 2007; FORMELLI et al., 2009; BONANNI; LAZZERONI, 2009).
Diversos estudos relataram efeitos inibitórios do crescimento de células de câncer de mama ER+ como MCF-7 e T47D por parte de retinóides (RUBIN et a., 1994; STEPHEN; DARBRE, 2000; CZECZUGA-SEMENIUK; LEMANCEWICZ; WOLCZYŃSKI, 200λ; SEAROVIC et al., 2009). Estudo recente investigou os efeitos do AR, nas concentrações de 10nM, 100nM ou 1µM, em células com graus progressivos de malignidade e que representavam os diferentes estágios da carcinogênese de mama. Observou-se, nesse caso, que quanto maior a agressividade das células, menor a resposta ao tratamento com o retinóide. (AHN; CHANG;TALMAGE, 2009).
Alguns trabalhos avaliaram em linhagens de câncer de mama o efeito de retinóides na forma de VA. Prakash et al.(2001) observaram que tratamento com 100nM ou 1µM de retinol inibiu significativamente o crescimento de células MCF-7 após período de 216hs. Já em células MDA-MB 231, houve estímulo de seu crescimento pelo retinóide, não se observando efeito em células Hs578T. Tratamento com concentração fisiológica de retinol (2,5µM) reduziu o crescimento de células MCF-7 em 22% e 32%, após período de 120hs e 144hs de tratamento, respectivamente (HAYDEN; SATRE, 2002). Por outro lado, de acordo com Mira- y-Lopes et al.(2000) concentrações de 0,5 a 2,0µM de retinol não inibiram o crescimento de células MCF-7, refletindo o metabolismo alterado da VA em células de câncer de mama. No presente estudo, observou-se inibição significativa do crescimento de células MCF-7 somente com tratamento com 20µM de VA, concentração quase 10 vezes maior que a fisiológica, após período de 120hs.
O AB tem sido considerado agente promissor para tratamento e prevenção do câncer, inclusive o de mama (MANDAL; KUMAR, 1996; BELOBRAJDIC; McINTOSH, 2000; TSUBAKI et al. 2001; PELLIZARO et a., 2001; CHOPIN et al., 2002; KUEFER et al., 2004; CHOPIN et al., 2004; NOHARA; YOKOYAMA; KANO, 2007; SANTOS; MARTINEZ- IGLESIAS; ARANDA, 2007; KUROIWA-TRZMIELINA et al. 2009). Em células de câncer de mama como a MCF-7, há relatos de inibição de até 75% de seu crescimento após tratamento com AB na concentração de 1 a 3mM, com aumento de células na fase G1 do ciclo
celular (MANDAL; KUMAR, 1996; CHOPIN et al., 2002). Além disso, o tratamento com 1mM de AB resultou em aumento do número de células na fase G2/M e G1, após período de 24 e 48hs, respectivamente, indicando inibição da proliferação celular. AB também induziu apoptose no período de 48hs a partir da concentração de 1mM, observando-se maior efeito com 2,5mM (CHOPIN et al., 2004). Tsubaki et al.(2001) observaram inibição da síntese de DNA pelo AB em padrão concentração dependente. Nesse caso, a concentração de 5mM inibiu a síntese de DNA em 90-100% em células MCF-7 e Hs578T. DAVIS et al. (2000) relataram que o AB promove inibição do crescimento de células MCF-7 em padrão concentração-dependente. Interessantemente, células de câncer de mama são mais sensíveis a ação do AB em comparação células de mama normal. No presente estudo, também se verificou que os tratamentos com 0,5 a 5mM de AB inibiram o crescimento de células MCF-7 de forma concentração-dependente. Isso poderia estar relacionado, eventualmente, à modulação da proliferação celular e/ou apoptose.
A associação de AR com HDACi resulta em efeitos aditivos na inibição do crescimento de células tumorais, bem como do desenvolvimento de tumores in vivo. Isso foi verificado em células de câncer renal resistentes ao tratamento com AR (SK-RC-39 e SK-RC- 45), bem como em neoplasias renais de ratos, após tratamento com associação de AR e TSA (MASSART; DENAIS; GIBASSIER, 2006). Em células de carcinoma de cabeça e pescoço (SqCC/Y1), AR isolado não influenciou o crescimento celular. Porém, a sua associação com TSA inibiu sinergicamente o crescimento dessas células (WHANG et al., 2005). Em células de leucemia mielóide (HL60) a associação de AB com AR agiu sinergicamente na indução de diferenciação (CHEN; BREITMAN, 1994).
Em células de câncer de mama MCF-7, associação de VPA com AR resultou em efeitos aditivos na inibição do crescimento celular (MONGAN; GUDAS, 2005). No presente estudo, o tratamento com VA, AB e VA+AB resultou em inibições do crescimento de células MCF-7, no período de 120hs, de 10%, 34% e 46%, respectivamente. Com base na fórmula proposta por Shiau et al. (2010) (% de inibição observado/% de inibição esperado) para se determinar a ocorrência de interações entre substâncias, verificou-se que o índice obtido foi igual 1, indicando que a associação de VA com AB resultou em efeito aditivo na inibição do crescimento de células de câncer de mama (MCF-7). Por outro lado, em células de neuroblastoma (SH-SY5Y), não se obteve efeito sinérgico ou aditivo na inibição do crescimento celular após tratamento com ácido retinóico e diversos inibidores de desacetilases de histonas (iHDACs), entre eles o AB (SANTOS; ZAMBRANO; ARANDA, 2007).
HDACis podem induzir diversas respostas biológicas em células tumorais, incluindo indução da apoptose e supressão da proliferação celular nos “checkpoints” G1/S ou G2/M (FREW; JOHNSTONE; BOLDEN, 2009), e são considerados grupo promissor de agentes
anticâncer (MARKS & XU, 2009).
Em 1970, descreveu-se que AB bloqueia a proliferação celular, altera a morfologia das células e modula a expressão gênica. A partir de estudos subseqüentes, verificou-se que as ações do AB são mediadas por meio da inibição da atividade HDAC, com conseqüente aumento da acetilação de histonas (DAVIE, 2003). Em células de neuroblastoma, por exemplo, concentrações de 1mM e 2mM de AB aumentaram de forma sustentada a acetilação de histonas H3K9/14, diferentemente de TSA, que apresentou efeito transitório nesse sentido (SANTOS; ZAMBRANO; ARANDA, 2007). Em alguns estudos in vivo, como o conduzido por KUROIWA-TRZMIELINA et al (2009) em ratos submetidos a hepatocarcinogênese, observou-se que a atividade quimiopreventiva do AB, fornecido na forma de seu pró-fármaco TB, foi associada a sua atividade de HDCAi com aumento da acetilação de histonas H3K9.
Mais especificamente no contexto do câncer de mama, AB, ao apresentar ação de HDACi, parece promover ações anti-estrogênicos por hiperacetilar histonas H3 e inibir a expressão de genes dependentes de ER (SANTOS; MARTINEZ-IGLESIAS; ARANDA, 2007). Além disso, a supressão da síntese de DNA por AB em células de câncer de mama (MCF-7 e Hs578T) pode estar associada com hiperacetilação de histonas (TSUBAKI et
al.,2001). No presente estudo, tratamento com 1mM de AB, isolado ou em associação com
VA, aumentou quase 10 vezes a acetilação de histonas H3K9 em células MCF-7, após período de 96hs, o que pode estar associado à inibição do crescimento celular por esse HDACi. AB também aumentou a acetilação de histonas H4 em células de melanoma, restaurando ou potencializando a resposta ao AR (DEMARY; WONG; SPANJAARD, 2001). Entretanto, diferentemente desses dados e de outros descritos na literatura (DAVIE, 2003), de acordo com resultados do presente estudo, AB parece não modular o padrão de acetilação de histonas H4K16 em células MCF-7.
No câncer há um desequilíbrio no padrão de metilação do DNA, geralmente associado com hipometilação global e hipermetilação da região promotora de determinados genes (KALEBIC, 2003; KANAI; HIROHASHI, 2007; DELAGE; DASHWOOD, 2008; KOK; VAN BREDA; MANSON, 2008). A hipometilação do DNA promove instabilidade cromossômica e aumento da expressão de genes, tais como oncogenes (BAYLIN; OHM, 2006; KANAI; HIROHASHI, 2007).
A hipometilação do DNA está presente em estágios iniciais da carcinogênese e o processo de perda de metilação pode aumentar progressivamente durante o desenvolvimento do tumor (SMET; LORIOT, 2010). Discute-se ainda que a localização do sítio de hipometilação no genoma é importante para o padrão de expressão gênica. Genes com sequências hipometiladas localizadas a 2kb antes ou após o sítio de início da transcrição são amplamente expressos, enquanto que genes com extensa hipometilação em regiões 3’-UTR (regiões não transcritas) e intragênicas são silenciados (SHANN et al., 2008). Células de câncer de mama MCF-7, bem como tumores de mama, apresentam hipometilação global quando comparada a células de mama normal (MCF-10-2A) ou tecido de mama normal (TRYNDYAK et al.,2006; SHANN et al., 2008).
Retinóides como VA, ácido retinóico todo-trans e ácido retinóico 9-cis promoveram em ratos hipometilação do DNA, por meio do aumento da expressão e atividade da glicina N- metiltransferase (GNMT), enzima chave na regulação da taxa de S- adenosilmetionina(SAM)/S-adenosilhomocisteína (SAH), importante para reações de transmetilação do DNA (ROWLING; MCMULLEN; SCHALINSKE, 2002). Já o AB parece não interferir no padrão de metilação global (SPURLING et al., 2008). No presente estudo, tratamentos de células MCF-7 com VA e AB, isolados ou em associação, não alteraram o padrão de metilação global.
Apesar de o mecanismo de ação exato da VA não estar totalmente esclarecido, descreve-se que o retinóide induz múltiplas vias de sinalização envolvidas com indução da apoptose, bloqueio do crescimento e diferenciação de células neoplásicas. Nesse contexto, considera-se que RARβ represente alvo molecular importante para as ações anti- carcinogênicas do AR (MONGAN; GUDAS, 2005).
Entretanto, no presente estudo apesar do tratamento com 10µM de VA ter resultado em inibição de cerca de 10 a 17% no crescimento de células MCF-7, não se observou aumento da expressão do gene para RARβ. Em células de câncer de cólon, o retinol inibiu o crescimento de células sensíveis e resistentes ao AR em um padrão independente de RAR (PARK et al., 2005). CHEN et al.(1997) observaram efeito inibitório por parte do retinol em células de câncer de mama MCF-7, mesmo na ausência da produção de AR, sugerindo que outros metabólitos como o 4-oxoretinol poderiam ter ações inibitórias do crescimento dessas células.
O tratamento de células MCF-7 com 1mM de AB, por sua vez, aumentou em 1,6 e 2 vezes a expressão de RARβ nos períodos de 96hs e 120hs, respectivamente. Isso poderia estar eventualmente relacionado à atividade de HDACi por parte do AB, considerando-se que no
período de 96hs esse aumentou em quase 10 vezes a acetilação de histonas H3K9. O tratamento de células de câncer de cólon com AB e AR associados, mas não isolados, aumentou a expressão de RARβ (SPURLING et al, 2008). Os autores desse estudo concluíram que os efeitos de AB na ativação de RARβ estão relacionados com sua atividade de HDACi e também, por promover demetilação da região promotora desse gene.
Outros estudos também mostram que associação de retinóides com HDACi favorece a reativação do gene RARβ, por aumentar a acetilação de histonas H3, em células de câncer de mama, inclusive as que são resistentes ao tratamento com AR, em células de melanoma, hepatocarcinoma e câncer renal, bem como em tumores in vivo (SIRCHIA et al., 2000; DEMARY; WONG; SPANJAARD, 2001; SIRCHIA et al., 2002; WANG et al., 2005; DELAGE; DASHWOOD, 2008; HAHN et al., 2008; TATEBE et al., 2009). Por outro lado, observou-se que a associação de VPA com AR não resultou em indução da expressão de RARβ em células MCF-7, apesar de ter inibido o crescimento celular. A indução da expressão de RARβ nesse caso só foi possível na presença de 5-aza-2’-deoxicitidina (MONGAN;GUDAS, 2005).Vale destacar que em nosso estudo, apesar de se ter constatado ações aditivas na inibição do crescimento de células MCF-7 com a associação de VA e AB, não se observaram diferenças quanto à indução da expressão de RARβ entre os tratamentos com AB isolado ou em associação com VA. Isso sugere que tais efeitos sejam atribuídos especificamente ao AB.
No presente estudo, nenhum dos tratamentos com VA, AB ou VA+AB foi capaz de alterar o padrão de hipermetilação do promotor do gene RARβ em células MCF-7. Entretanto, a desmetilação do promotor do gene RARβ parece não ser o único mecanismo necessário para sua transcrição, visto que a sua expressão pode ser induzida mesmo na presença de hipermetilação (SIRCHIA et al., 2000), como descrito para o AB no presente estudo, ou considerando-se, ainda, que supressão desse gene pode ocorrer mesmo na ausência desse tipo de alteração epigenética (WIDSCHWENDTER et al., 2001).
Em células MCF-7, a reativação do gene RARβ só é possível quando se promove um nível adequado de acetilação de histonas com um HDACi, visto que nessas células o promotor desse gene apresenta-se desacetilado. No caso de células de câncer de mama T-47D, doses farmacológicas de AR são capazes de reativar RARβ, uma vez que esse se apresenta hipoacetilado (SIRCHIA et al., 2002).
O gene CRBP-I apresenta importante papel no metabolismo da VA, tanto para a biossíntese de AR a partir de retinol , como para o armazenamento de VA na forma de éster
de retinila (CHEN et al., 1997; TAIBI et al., 2009). O gene CRBP-I também apresenta-se inativo em células de carcinoma mamário como MCF-7 e MDA-MB-231 (KUPPUMBATTI
et al., 2000, 2001; ARAPSHIAN et al., 2004; TAIBI et al., 2009), levando ao
comprometimento do metabolismo de AR pela redução do transporte e armazenamento do retinol (ONG et al., 1994; BAVIK; WARD; ONG, 1997). A perda da expressão do gene CRBP-I está relacionada à hipermetilação da sua região promotora (ARAPSHIAN et al., 2004; LOTAN, 2005; WILLIAMS; CYETKIVIC; HAMILTON, 2009). No presente estudo, observou-se que em células MCF-7, o gene CRBP-I apresenta reduzida expressão (cerca de 200 vezes menor em comparação a células de mama normal). Além disso, nenhum dos tratamentos com VA, AB ou VA+AB foi capaz de aumentar a expressão do gene CRBP-I em células MCF-7.
Não se detectou a presença de palmitato de retinila nas células MCF-7 mesmo após os diversos tratamentos. Isso confirma achados na literatura de que diferentemente de células mamárias normais MCF-10A e AD074, células MCF-7 não apresentam a capacidade de esterificar retinol, em parte devido à perda de expressão do gene CRBP-I (CHEN et al., 1997, KUPPUMBATTI et al., 2000, 2001; ARAPSHIAN et al., 2004; TAIBI et al., 2009).
Além disso, somente as células tratadas com VA apresentaram no período de 120hs maior concentração de retinol em comparação às células controle. Hyden & Satre (2002) ao estudarem o metabolismo do retinol em célula normal de mama (HMEC) e linhagens tumorais (MCF-7 e MDA-MB-231), observaram que apesar de todas as células captarem o retinol do meio, somente as células HMEC foram capazes de produzir eficientemente AR e armazenar retinol na forma de palmitato de retinila. Em células HMEC, as concentrações de retinol reduziram-se drasticamente após 6hs de tratamento, enquanto que as de palmitato de retinila e AR aumentaram. Já nas linhagens neoplásicas, as concentrações de retinol permaneceram elevadas até 72hs de tratamento, enquanto que as de AR permaneceram reduzidas e as de palmitato de retinila praticamente não detectadas, indicando metabolismo de VA alterada nessas células. Também in vivo, mais especifcamente em tumores de mama induzida por N- metil-N-nitrosouréia em ratas, não se detectou a presença de retinol e palmitato de retinila (BHAT; LACROIX, 1989).
Com base nos resultados, a associação de VA e AB resultou em efeito inibitório aditivo do crescimento de células MCF-7. Acetilação de histonas H3K9, mas não de H4K16 e metilação do DNA, parece representar alvo epigenético do AB. Aumento da expressão do gene supressor de tumor RARβ parece estar envolvido na inibição do crescimento de células MCF-7 pelo AB. Ausência de esterificação do retinol em células MCF-7 tratadas ou não com
VA e AB, isolados ou em associação, parece se relacionar à expressão reduzida do gene CRBP-I.
7 CONCLUSÕES
A associação de 10 M de VA com 1mM de AB resultou em efeito inibitório aditivo do crescimento de células MCF-7.
Acetilação de histonas H3K9 parece ser alvo epigenético do AB, mas não da VA.
Metilação do DNA e acetilação de histonas H4K16 não parecem ser alvos epigenéticos da VA e AB, isolados ou em associação.
Aumento da expressão do gene supressor de tumor RARβ parece estar envolvido na inibição do crescimento de células MCF-7 pelo AB, mas não por VA.
O gene CRBP-I não parece estar envolvido na inibição do crescimento de células MCF-7 pela VA e AB, isolados ou em associação.
Células MCF-7 não esterificam retinol devido, em parte, à redução da expressão do gene CRBP-I.
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