1.3 Tidligere arbeid om p-type TCOer
1.3.3 Spinell-type materialer
5.2.1 Resultados in vitro
5.2.1.1 Efeito de FDP em anéis de artéria mesentérica isolada de rato pré- contraídos com FEN (1 µM)
Nos anéis pré-contraídos com FEN (1 µM), a adição cumulativa de FDP (0,01 – 500 µg/mL) promoveu um efeito vasodilatador, com endotélio intacto (Emáx = 80,6 ± 5,8%; CE50 = 24,1 ± 8,9 µg/mL), de maneira dependente de
concentração. Após a remoção do endotélio funcional, os parâmetros avaliados de eficácia e potência não foram alterados de forma significativa (Emáx = 95,6 ±
7,5%; CE50 = 23,70 ± 5,65 mg/mL, respectivamente) (Gráfico 11). Este
resultado sugere que a resposta vasorrelaxante da fase de Dictyota pulchella independe dos fatores relaxantes derivados do endotélio vascular.
O tempo necessário para que fossem obtidas as respostas máximas para cada concentração de FDP foi de 10 minutos, sendo um tempo total de relaxamento máximo aproximado de 110 minutos (Figura 18).
Em todos os experimentos subsequentes foram utilizados anéis após a remoção do endotélio vascular para investigar o mecanismo de ação envolvido no efeito vasorrelaxante de FDP.
QUEIROZ, T. M. 76
Figura 18- Registros originais das resposta de FDP (0,01 – 500 µg/mL) em anéis pré- contraídos com FEN (1 µM) com o endotélio intacto (A) ou após sua remoção (B)
FDP (0,01 – 500 µg/mL) 0,01 0,1 0,3 1 3 10 30 0,03 100300 500
B)
A)
FDP (0,01 – 500 µg/mL) 0,01 0,1 0,3 1 3 10 30 0,03 100300 500QUEIROZ, T. M. 77
Gráfico 11 - Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por FDP (0,01 – 500 µg/mL) em anéis da artéria de artéria mesentérica superior isolada de ratos com
endotélio intacto (▼) (n=6) ou endotélio ausente (□) (n=7), pré-contraídos com FEN
(1 µM)
5.2.1.2 Efeito de FDP em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré-contraídos com solução despolarizante de 60 mM de KCl
Em anéis mesentéricos, com endotélio funcional removido, pré- contraídos com uma solução despolarizante de 60 mM de KCl, foi verificado um efeito vasorrelaxante, pela adição cumulativa de FDP (Emáx = 113,5 ± 6,1%;
CE50 = 10,92 ± 2,81 µg/mL; n=6), não sofrendo alteração, quando comparada
ao efeito do FDP sobre anéis pré-contraídos com FEN (Emáx = 95,6 ± 7,5%;
CE50 = 23,70 ± 5,65 mg/mL; n=7) (Gráfico 12). -2 -1 0 1 2 3 0 25 50 75 100 Log [FDP] M % R el ax am en to
QUEIROZ, T. M. 78
Gráfico 12- Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por FDP (0,01 – 500 µg/mL) em anéis da artéria de artéria mesentérica superior isolada de ratos sem
endotélio, pré-contraídos com FEN (1 µM) (□) ou pré-contraídos com KCl 60 mM (●)
(n= 7)
5.2.1.3 Efeito de FDP sobre as concentrações induzidas por CaCl2 em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato
FDP nas concentrações de 0,03; 0,3; 10; 30 e 100 µg/mL inibiu de maneira dependente de concentração as contração induzidas por CaCl2 (10-6,
3 x 10- 6, 10-5, 3 x 10-5, 10-4, 3 x 10-4, 10-3, 3 x 10-3 e 10-2 M) em solução despolarizante nominalmente sem Ca+2. As curvas cumulativas ao CaCl2 foram
desviadas significativamente para direita com redução do efeito máximo, como pode ser observado no (Gráficos 13).
-2 -1 0 1 2 3 0 25 50 75 100 125 Log [FDP] M % R el ax am en to
QUEIROZ, T. M. 79
Gráfico 13 - Efeito de FDP frente às curvas concentrações-resposta cumulativas de CaCl2
(10-6 – 10-2) em meio despolarizante nominalmente sem Ca+2 em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de rato (n = 6). Curva controle (■) e na presença de
concentrações isoladas de EDP ( em µg/mL): 0,03 (●); 0,3 (▼); 10 (∆); 30 (◊) e 100 (x).
*p<0,05 ([EDP] versus controle)
-6 -5 -4 -3 -2 0 20 40 60 80 100 120 140 * * * * * Log [ CaCl2] M % R es p o st a M áx im a
QUEIROZ, T. M. 81
6 DISCUSSÃO
O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar os efeitos do extrato (EDP) e fase (FDP) da alga marinha Dictyota pulchella sobre o sistema cardiovascular de ratos, tentando elucidar os possíveis mecanismos de ação envolvidos em suas respostas. No desenvolvimento deste estudo foram empregados dois modelos de abordagens metodológicas. Na primeira abordagem foram utilizadas técnicas experimentais de estudo in vivo para avaliar o efeito de EDP sobre a PAM e FC em ratos normotensos não anestesiados. Na segunda, foram utilizados ensaios in vitro para avaliação funcional de EDP e FDP em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos.
A principal constatação deste estudo foi que, na avaliação dos parâmetros hemodinâmicos de PAM e FC, o extrato CH2Cl2:MeOH de Dictyota pulchella (EDP) promoveu hipotensão e bradicardia. O efeito hipotensor
induzido por EDP pode estar relacionado com a diminuição da resistência vascular periférica em artéria mesentérica superior de rato. A diminuição da RVP envolve bloqueio do influxo de Ca2+ por meio da inibição dos canais para cálcio sensíveis a voltagem tipo-L.
Com o intuito de avaliar o efeito de EDP sobre a PAM e FC, utilizou-se a metodologia de aferição dos parâmetros hemodinâmicos em animais não anestesiados e com livre movimentação, uma vez que a anestesia modifica os níveis de PA e FC, além do funcionamento dos principais sistemas envolvidos na regulação da PA, tais como o SRAA, sistema nervoso simpático e o barorreflexo, e ainda produz depressão de algumas sinapses do sistema nervoso central, alterando as respostas autonômicas (FLUCKIGER et al., 1985; DORWARD et al., 1985; KORNER et al., 1968; ZIMPFER et al., 1982).
Em experimentos realizados in vivo, a administração aguda de EDP induziu uma hipotensão seguida de bradicardia intensa, sendo a maior dose testada (40 mg/kg) responsável por mais de 70% de redução da FC quando comparada com os valores na ausência do extrato (Gráfico 1). Mudanças na FC têm sido comumente observadas em vários tipos de drogas anti- hipertensivas, nas quais a taquicardia tem se mostrado ser um fator de risco
QUEIROZ, T. M. 82
para eventos pós-isquêmicos e doenças cardiovasculares (PALATINI et al., 1996; CAI et al., 2011). No entanto, drogas, com efeito, bradicárdico, como os beta bloqueadores e bloqueadores dos canais de cálcio (SOCIEDADE EUROPÉIA DE HIPERTENSÃO, 2003), têm sido recomendadas para uso na terapia no combate da elevação da PA (CAI et al., 2011).
Para uma melhor compreensão da natureza dos efeitos observados nos estudos in vivo e com base nos relatos que destacam um importante papel na manutenção da PA é desempenhado por alterações do tônus da musculatura lisa vascular (FOLKOW, 1987; MULVANY; AALKJAER, 1990), sendo os canais de cálcio importantes reguladores da contratilidade do músculo liso dos vasos (THORNELOE; NELSON, 2005), passou-se a investigar a atividade de EDP sobre anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.
Durante muitos anos, o endotélio era considerado uma barreira inerte que separava o fluxo sanguíneo do tecido adjacente. Com o tempo o endotélio vascular passou a seu estado atual de uma camada de células ativa no papel de reguladora da homeostase, tráfico celular e de nutrientes e no controle do tônus vascular (GROVER-PÁEZ; ZAVALZA-GÓMEZ, 2009). Esta camada de células reveste internamente o lúmen dos vasos sanguíneos e serve como uma glândula secretória que produz tanto fatores relaxantes como contracturantes que determinam o controle do tônus vascular. Em condições fisiológicas existe um equilíbrio entre estas substâncias, prevalecendo o efeito dos agentes relaxantes. Estes incluem: o NO, prostaciclinas e o EDHF (MONCADA; VANE, 1978; FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980).
A partir das considerações sobre o endotélio vascular, passou-se a avaliar a sua participação na resposta relaxante induzida por EDP. Em anéis de artéria mesentérica, EDP induziu vasorrelaxamento dependente de concentração sobre o tônus induzido por FEN (1 e 10 µM) (Figura 16), um agonista dos receptores α1-adrenérgicos (BYLUND, 1992; BÜSCHER et al.,
1999). Estes receptores estão acoplados a proteína Gq/11 e promovem ativação
da fosfolipase C-β (PLCβ). Esta enzima catalisa a hidrólise do fosfatidil-inositol
4,5 bifosfato (PIP2) em IP3 e diacilglicerol (DAG), o IP3 ativa os receptores para
IP3 do retículo sarcoplasmático (compartimento intracelular de estoque de
QUEIROZ, T. M. 83
elevação do Ca2+ promove ativação da proteína cinase c (PKC). Tal ativação
induz a fosforilação de enzimas envolvidas no processo contrátil, como a MLCP, inibindo-a. Todos estes eventos levam a contração do músculo liso vascular (MCCARRON et al., 2003; THORNELOE; NELSON, 2005). O vasorrelaxamento na presença deste agonista mostrou-se equipotente quando comparados com os valores de eficácia e potência tanto para anéis na presença do endotélio funcional, como naqueles onde o endotélio foi removido, levando a hipótese de que o vasorrelaxamento produzido pelo extrato não parece ser mediado por fatores relaxantes derivados do endotélio vascular, podendo ser um efeito de EDP direto no músculo liso vascular (Gráficos 2 e 3). Nesse contexto, avaliou-se o efeito induzido por EDP sobre o tônus vascular basal (na ausência de agentes contracturantes). Foram adicionadas ao tônus basal concentrações crescentes de EDP, tanto na presença como na ausência do endotélio vascular, sendo observado que EDP não alterou o tônus basal nas duas situações avaliadas, sugerindo-se que para a atividade vasorrelaxante de EDP é necessário haver uma pré-contração (Gráfico 4).
É bem descrito que a contração das células musculares lisas vasculares é controlada pela [Ca2+]i, que por sua vez sofre influência direta das
modificações elétricas que ocorrem na membrana destas células. Tais modificações ou potenciais de membrana são determinados pelo balanço entre despolarização e hiperpolarização, decorrentes da atividade de uma grande variedade de canais iônicos presentes na membrana das células favorecendo, desta forma, a contração ou o relaxamento, respectivamente. A despolarização é mediada pela atividade dos Cav, canais de cloreto e canais catiônicos não
seletivos. Os canais para K+ agem como ferramentas hiperpolarizantes e
promovem uma retroalimentação negativa na excitação, de maneira que muitos canais para K+ são ativados pela despolarização de membrana (canais para K+
sensíveis a voltagem - Kv) e/ou aumento do Ca2+ citoplasmático, a exemplo dos
canais para K+ sensíveis ao Ca(K
ca) (THORNELOE; NELSON, 2005).
Drogas vasodilatadoras, cujos mecanismos são dependentes de canais para K+, têm uma perda de seus efeitos quando expostos a soluções com alta concentração de K+, pelo fato de que esse aumento do K+ extracelular atenua o gradiente deste íon através da membrana, tornando, assim, o mecanismo de ativação destes canais ineficaz (KHAN; HIGDON; MEISHERI, 1998; MENEZES
QUEIROZ, T. M. 84
et al., 2007). Sabendo desta grande importância da participação dos canais para K+ na regulação do tônus vascular, fomos investigar se estes canais estariam envolvidos na resposta vasodilatadora de EDP. O aumento da [K+]
extracelular (de 4 para 20 mM) não alterou significantemente o vasorrelaxamento induzido por EDP (Gráfico 5), sugerindo que a resposta relaxante induzida pela alga, provavelmente, não envolve a participação destes canais.
No intuito de reforçar que os canais para K+ não tem participação no
efeito vasorrelaxante induzido por EDP, realizou-se experimentos na presença de TEA (3 mM), que nesta concentração é responsável por bloquear de maneira não seletiva os canais para K+ (WANG et al., 2007). Nestas condições experimentais, observou-se que o relaxamento produzido foi similar ao obtido nos tecidos pré-contraídos com FEN (Gráfico 6). Corroborando com os resultados observados com 20 mM de KCl, da não participação dos canais para K+ na resposta vasorrelaxante promovida pelo composto em estudo.
Para avaliar se o efeito de EDP era dependente exclusivamente de um único agonista contracturante, como sobre os receptores α1-adrenérgico, foi
utilizado outro agente contracturante, o U46619, um agonista tromboxânico A2
(TXA2) (CAVARAPE, et al., 2003) que atua nos receptores TP acoplados à
proteína Gq (PLC-IP3-Ca2+) (GOODMAN; GILMAN, 2006; AUDOLY, et al.,
2000). Nestas condições experimentais, observou-se que o relaxamento produzido por EDP em anéis pré-contraídos com U46619, foi similar ao obtido no tecido pré-contraído com FEN (Gráfico 7).
Outra forma de promover a contração de preparações com anéis mesentéricos é por meio da utilização de altas concentrações de K+ no meio
experimental. Estudos mostram que contrações induzidas por altas concentrações de potássio, nas células de músculo liso, são mediadas por uma despolarização de membrana e um aumento do influxo de Ca2+ através dos
Cav (GODFRAIND; MILLER; WIBO, 1986; SOMLYO; SOMLYO, 1994;
BRIGGS, 1962; NELSON et al., 1988). No entanto, estudos recentes (RATZ; BERG, 2006) demonstraram que essa contração sustentada não é exclusivamente mediada por Cav, mas também, baseada no fato de que o KCl
pode causar depleção do retículo sarcoplasmático (KOBAYASHI; KANAIDE; NAKAMURA, 1985 e 1986), levando a uma entrada de Ca2+ através SOCs e ou
QUEIROZ, T. M. 85
canais TRP (AY et al., 2004; FELLNER; ARENDSHORST, 2000; USACHEV; THAYER, 1999; WAYMAN; GIBSON; MCFADZEAN, 1998), como também outro relevante aspecto é que o aumento de K+ extracelular pode levar a uma
ativação da PKC, culminando com uma ativação da MYPT1, induzindo a uma sensibilização ao cálcio e com isso uma contração sustentada (RATZ; MINER, 2009). Avaliou-se, portanto, o efeito de EDP em anéis pré-contraídos com a solução despolarizante com 60 mM de KCl e, nestas condições, observou-se que EDP promoveu relaxamento de maneira dependente de concentração, semelhante ao relaxamento promovido em preparações contraídas com FEN (Gráfico 8). Sendo, portanto um forte indício de que a vasodilatação induzida por EDP, envolve um passo comum na via de sinalização celular, visto que os outros agentes contracturantes empregados também promovem aumento citosólico dos níveis de cálcio (GALICIA et al., 2008). Possivelmente, o mecanismo vasodilatador do EDP envolve a inibição do influxo de cálcio.
Para verificar essa hipótese foi investigado o efeito de EDP frente às contrações induzidas por CaCl2, em meio despolarizante nominalmente sem
cálcio. Este protocolo experimental fundamenta-se no fato de que as contrações induzidas por CaCl2 são geradas, quase que exclusivamente, pelo
influxo de Ca2+, já que a despolarização promovida por concentrações elevadas de K+ extracelular induz a abertura dos Cav (RATZ; BERG, 2006).
Nestas condições, EDP atenuou significativamente as contrações induzidas por CaCl2, de maneira dependente de concentração (Gráfico 9). Estes resultados
sugerem que o efeito vasorrelaxante induzido por EDP pode ser devido a uma possível influência da alga sobre os Cav, resultando em uma diminuição do
influxo de Ca2+ no músculo liso de artéria mesentérica superior isolada de rato,
levando ao vasorrelaxamento.
A superfamília dos Cav é constituída por pelo menos 10 membros
distribuídos em muitos tecidos. Nas CMLV dois tipos principais são expressos, os Cav1 (tipo-L) e os Cav3 (tipo-T). Os primeiros que são caracterizados pela
sensibilidade a diidropiridinas, uma classe de drogas usadas clinicamente no tratamento da hipertensão por bloquear seletivamente os canais Cav do tipo-L
(NELSON et al., 1990). Os canais sensíveis a diidropiridinas, localizados nos vasos sanguíneos, são referidos como Cav 1.2 e considerados os mais
QUEIROZ, T. M. 86
resistência vascular e, consequentemente, na pressão sanguínea (CATERRAL et al., 2005; KEEF; HUME; ZHONG, 2001).
Para investigar o subtipo de Cav envolvido na resposta vasodilatadora
induzida por EDP, analisou-se seu efeito sobre as contrações tônicas induzidas pelo derivado diidropiridínico S(-)-Bay K 8644, um agonista seletivo dos Cav 1
(SCHRAMM et al., 1983). Nesta situação, foi observado que EDP inibiu as contrações tônicas induzidas por S(-)-Bay K 8644, de maneira dependente de concentração, sugerindo que os Cav 1 podem estar envolvidos na resposta
vasorrelaxante induzida por EDP (Gráfico 10).
Trabalhos fitoquímicos realizados com a fase hexano:acetato (90:10) de Dictyota pulchella revelaram que esta possui em sua constituição diterpenos, sendo reportado o isolamento de três diferentes, são eles: (4R,7R,14S)-4α,7α-diacetoxi-14α-hidroxidolast-1(15),8-dieno; (4R,14S)-4α,14α- dihidroxidolast-1(15),8-dieno (amijiol), e um diterpeno dolastano inédito, o 2β- hidroxidolast-1(15),9-dieno (pulchellol) (FIGUEIREDO, 2009).
Pesquisas têm demonstrado que a classe de metabólitos secundários dos terpenos possui várias atividades no sistema cardiovascular. Estudos revelaram que monoterpenos do tipo citronellol e α-terpineol apresentaram atividade hipotensora e vasorrelaxante (BASTOS et al., 2010; RIBEIRO et al., 2010), como também diterpenos tipo caurano mostraram possuir efeito hipotensor e vasodilatador coronariano, ambos acompanhados de uma diminuição gradual da frequência cardíaca (SOMOVA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2006).
Diante do expressivo efeito de EDP sobre PA e FC, como também em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, motivou-se a busca de um provável composto neste extrato que estaria causando tais atividades farmacológicas. Com base na constatação de que FDP contém diterpenos e, segundo pesquisas, esses metabólitos podem atuar na regulação do sistema cardiovascular, a fase hexano:acetato foi avaliada utilizando uma abordagem in
vitro em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos.
Inicialmente avaliou-se a participação do endotélio vascular na resposta induzida por FDP, já que o endotélio é uma camada de células responsável pela liberação de substâncias vasoativas que controlam a resistência vascular periférica (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980;
QUEIROZ, T. M. 87
FURCHGOTT; VANHOUTTE, 1989). Verificou-se que o endotélio vascular não interfere no relaxamento, concentração dependente, provocado por FDP, pois a vasodilatação não sofreu alteração significante quando o endotélio foi mecanicamente removido (Gráfico 11).
Quando a concentração externa de potássio é elevada (60 mM), desencadeia então uma despolarização da membrana celular, eliminando o efeito dos fatores hiperpolarizantes e promovendo a abertura dos canais de cálcio dependentes de voltagem (tipo L e T), o que resulta em uma alta concentração de cálcio intracelular de maneira sustentada (BUUS et al., 2006). Assim, na ausência do endotélio vascular, foi realizada a adição de uma solução despolarizante de 60 mM de KCl aos anéis de artéria mesentérica, observando-se uma contração que sabe-se ser proveniente da abertura dos Cav (OLIVEIRA et al., 2006). O resultado obtido, com adição cumulativa de
FDP, foi um vasorrelaxamento dependente de concentração, não tendo diferença significante da pré-contração por FEN (1 µM) (Gráfico 12).
Os resultados observados nos anéis mesentéricos pré-contraídos com 60 mM de KCl sugerem que FDP possui uma atividade sobre o influxo de cálcio através dos canais de cálcio dependentes de voltagem. Esta hipótese é reforçada pelos resultados obtidos nos experimentos realizados com a adição cumulativa de CaCl2, de forma que esta foi realizada em um meio
despolarizante e livre de cálcio (60 mM de KCl nominalmente sem cálcio), onde as concentrações isoladas de FDP promoveram a inibição da contração de forma concentração dependente (Gráfico 13).
Os efeitos observados nos experimentos com FDP dão indícios de que os componentes desta fase é que são os responsáveis pelos efeitos do extrato de Dictyota pulchella, já que o extrato apresentou um efeito vasorrelaxante independente dos fatores relaxantes derivados do endotélio e que este efeito parece envolver o bloqueio do influxo de cálcio por meio dos canais para cálcio sensíveis a voltagem. Porém, experimentos posteriores necessitam ser realizados para a confirmação destes efeitos, bem como a comprovação de que os diterpenos isolados desta fase são agentes moduladores desses efeitos farmacológicos.
QUEIROZ, T. M. 89
7 CONCLUSÕES
Em conclusão, estes resultados, obtidos usando metodologias combinadas (in vivo e in vitro), demonstram que:
1) EDP produz hipotensão e bradicardia,
2) EDP e FDP promoveram uma diminuição da RVPT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato;
3) O efeito vasorrelaxante do extrato quanto da fase é independente do endotélio vascular;
4) Este efeito envolve o bloqueio do influxo de cálcio, por meio dos canais de cálcio sensíveis a voltagem do tipo-L.
QUEIROZ, T. M. 91
8 PERSPECTIVAS
Investigar os efeitos cardiovasculares da fase hexano:acetato de etila da alga Dictyota pulchella (9:1) (FDP), bem como de suas frações (diterpenos isolados), em ratos normotensos e hipertensos, por meio de uma abordagem in
vivo e in vitro, procurando elucidar os possíveis mecanismos implicados nestes
efeitos.
QUEIROZ, T. M. 93
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