Sivilrettslig

Foi analisada a associação entre a LOH de cada um dos marcadores estudados e as alterações citológicas e arquiteturais do epitélio, apresentação clínica das lesões (homogênea/heterogênea), sítio de acometimento das lesões (alto/baixo risco), tamanho da lesão, hábito tabagista e imuno positividade para as proteínas p53 e ki67. Adicionalmente, foi testada a associação entre a FAL e as alterações citológicas e arquiteturais do epitélio, apresentação clínica das lesões (homogênea/heterogênea), sítio de acometimento das lesões (alto/baixo risco), tamanho da lesão, hábito tabagista e imuno positividade para as proteínas p53 e ki67.

A partir dessas análises, foi possível observar a associação entre a graduação histopatológica dos espécimes e a FAL (p<0,05), na qual o aumento da frequência de perda alélica foi associado à displasia acentuada e CCEB (Figura 11).

Figura 11: Representação gráfica da distribuição da porcentagem da frequência de perda alélica em relação com a graduação histopatológica das amostras de leucoplasia (n=34).

p = 0,005*

* teste Mann-Whitney

Nas amostras de leucoplasia (n=32) foi testada a associação entre a LOH dos diferentes marcadores e as alterações citológicas e arquiteturais das displasias. Observou-se que a presença de projeções em forma de gota foi associada à LOH no marcador D9S162 (p=0,012). A presença de ceratinização celular prematura foi associada à LOH no marcador P53 (p=0,028). A presença de núcleos aumentados de tamanho foi associada à LOH no marcador D9S171 (p=0,043). A presença de nucléolos numerosos e aumentados foi associada à LOH no marcador D9S162 (p=0,026). Adicionalmente a esses resultados, o aumento da porcentagem da frequência de perda alélica foi associado à presença de mitoses superficiais anormais (p=0,028).

5.4 IMUNOHISTOQUÍMICA

Os resultados da imunohistoquímica estão apresentados na tabela 7. A expressão de p53 e ki67 foi detectada na maioria dos casos nas camadas basal/parabasal e suprabasal. Apenas uma amostra para p53 (primeira biópsia do caso #9) e duas amostras para ki67 (segunda biópsia do caso #2 e primeira biópsia do caso #8) apresentaram expressão das proteínas restrita nas camadas basal e parabasal. Esses casos exibiram displasia epitelial leve. Vinte e sete amostras (79,4%) foram positivas para p53, independentemente do grau de displasia. A positividade para p53 não foi associada a LOH em nenhum dos marcadores. Contudo, a imuno positividade de p53 foi associada à presença de alterações do tamanho nuclear (p=0,043).

A percentagem de núcleos positivos ki67 variou de 1,3% a 41,7%. O aumento de ki67 foi associado às lesões heterogêneas nas amostras da segunda biópsia dos pacientes (ver item 5.4). Em adição, não houve diferença estatística entre o percentual de positividade ki67 e os diferentes graus de displasia. Todavia, foi possível observar o

aumento gradativo do número de células positivas, na medida em que o grau de displasia aumentava.

6. DISCUSSÃO

A leucoplasia bucal é a principal lesão cancerizável da boca e representa cerca de 80% de todas as lesões com potencial de malignização da cavidade bucal (Bouquot 1991; Bouquot 1994; Barnes, Eveson et al. 2005). As taxas de transformação maligna das leucoplasias variam de 2,4% a 36%. Contudo, os fenômenos que propiciam a malignização ainda não são conhecidos.

Atualmente, os aspectos clínicos das lesões associados aos achados histopatológicos são os principais parâmetros utilizados para a indicação de possibilidade de transformação maligna da leucoplasia bucal (Jiang, Fujii et al. 2001; Reibel 2003; Tilakaratne, Sherriff et al. 2011). Todavia, nem todas as leucoplasias que apresentam displasias epiteliais irão sofrer transformação maligna. A literatura descreve que cerca de 15% das lesões leucoplásicas que sofrem a transformação maligna não possuem atipias celulares (Silverman, Gorsky et al. 1984; Silverman, Gorsky et al. 1996). Assim, é importante ressaltar que a graduação histopatológica não é capaz de predizer quais lesões vão sofrer ou não transformação maligna.

Nesse contexto, fica claro que o atual modelo de predição do comportamento biológico destas lesões é frágil e não traduz com eficiência e objetividade a evolução das LB. A caracterização dos eventos genéticos na leucoplasia pode permitir a definição das lesões que demonstram comportamento clínico mais agressivo, o que pode impactar em estratégias de prognóstico e tratamento das lesões. Além disso, estudos gênicos e moleculares podem fornecer informações adicionais ao modelo de graduação das displasias quando combinados às características clínicas e histopatológicas (Califano, Westra et al. 2000; Bloching, Barnes et al. 2007).

Diversos estudos têm demonstrado que alterações genéticas como a LOH em regiões próximas a genes supressores de tumor estão presentes nas leucoplasias e

poderiam ser capazes de predizer o comportamento biológico dessas lesões (Mao, Lee et al. 1996; Califano, Westra et al. 2000; Rosin, Cheng et al. 2000; Zhang & Rosin 2001; Zhang, Cao et al. 2010; Cavenee 2012). Nesse sentido, o presente estudo investigou a LOH em marcadores de microssatélites localizados nas regiões cromossômicas 3p, 9p, 11p, 11q e 17p em amostras de LB, com foco nas alterações citológicas e arquiteturais do epitélio das lesões, bem como com os dados clínicos dos pacientes.

Ha e colaboradores (2002) relataram que as alterações genéticas em microssatélites aumentam na medida em que as displasias celulares do epitélio se tornam mais graves, além de potencializar os eventos de transformação maligna (Ha, Pilkington et al. 2002). Esse achado pode ser identificado no presente estudo tendo em vista que o aumento da FAL foi observado nas amostras que apresentaram displasias celulares acentuadas e nos carcinomas. Esse achado sugere que o aumento da LOH pode estar relacionado com a transformação maligna da leucoplasia. No entanto, apesar das alterações gênicas estarem associadas às displasias epiteliais mais exuberantes, ainda não foi possível identificar se estes fenômenos ocorrem como causa ou consequência do comportamento biológico das lesões.

O aumento da frequência de perdas alélicas nas displasias acentuadas pode sugerir o comportamento genético instável dessas lesões, o que, consequentemente, poderia ser refletido no padrão histopatológico desorganizado do tecido. Contudo, é importante salientar que em algumas lesões com displasia epitelial leve foram percebidas perdas alélicas superiores a 70%, semelhantes aos casos de displasias acentuadas e de carcinomas. Nesses casos, a literatura suporta que o aumento de LOH pode estar relacionado com o aumento do risco de transformação maligna,

et al. 1996; Califano, Westra et al. 2000; Rosin, Cheng et al. 2000; Zhang & Rosin 2001; Rosin, Lam et al. 2002; Zhang, Cao et al. 2010).

Nas amostras de CCEB foi observado LOH nas regiões cromossômicas 3p, 9p, 11q e 17p, diferentemente da maioria das amostras de LB, com exceção de um espécime. Esse achado pode sugerir um padrão diferencial de LOH entre a leucoplasia e o carcinoma. Entretanto, não foi encontrado nenhum perfil de LOH que pudesse predizer a transformação maligna das lesões.

A displasia epitelial da LB é classificada com base nas alterações citológicas e arquiteturais do epitélio. No entanto, não se sabe quais alterações moleculares estão associados a cada um dos parâmetros utilizados para graduar a displasia. No presente trabalho observou-se que a LOH nos marcadores de microssatélites D9S162, D9S171 e P53 localizados nas regiões 9p e 17p foi associada a alterações citológicas e arquiteturais do epitélio. Estes resultados indicam que pode haver um perfil molecular para cada anormalidade citológica e arranjo arquitetural da displasia.

O presente estudo é o primeiro trabalho da literatura que descreve a associação de LOH a alterações citológicas e arquiteturais do epitélio em leucoplasias. Esses achados sugerem que a LOH dos marcadores D9S162, D9S171 e P53 parecem ser importantes na determinação das alterações histopatológicas das displasias. As associações encontradas configuram partes de um padrão molecular característico das alterações citológicas e arquiteturais que precisa ser mais estudado.

A imuno detecção da proteína p53 foi observada em mais de 75% das amostras analisadas. Além disso, a positividade da p53 foi associada com a presença de alterações do tamanho nuclear. Tais achados sugerem uma possível acumulação da p53 pelas células epiteliais que compõem o quadro de displasia. A proteína p53 detectada nas camadas suprabasais reflete um processo de instabilidade celular funcional que pode

ser interpretado como uma resposta celular frente ao dano genético irreversível. Além disso, o acúmulo da p53 pode indicar a presença de proliferação de células com danos no DNA (Cruz, 1998). Alternativamente, a acumulação da p53 também pode ocorrer em resposta ao stress celular resultando na estabilização da proteína no núcleo da célula (Cox 2012; Gomes, Diniz et al. 2012; Gomes, Fonseca-Silva et al. 2013).

Outra proteína avaliada neste estudo foi a ki67, que é uma molécula relacionada com a proliferação celular. A literatura relata que a detecção e quantificação das células em proliferação, através da avaliação da ki67, constituem parâmetros importantes na caracterização de diversas neoplasias, como carcinoma de pulmão, mama, cabeça e pescoço. Recentemente, inclusive, os índices proliferativos vêm sendo estudado em lesões cancerizáveis (Liu, Lawson et al. 2003; Angiero, Berenzi et al. 2008; Colozza, Sidoni et al. 2010; Ciancio, Galasso et al. 2012).

Adicionalmente, a literatura sugere que o aumento da ki67 está associado à LOH nas regiões 3p, 9p e 17p (Tabor, Braakhuis et al. 2003; Dwivedi, Chandra et al. 2013). Contudo, a imuno positividade da ki67 não foi associada à LOH em nenhum dos marcadores estudados no presente trabalho. Essa contra posição de resultados pode refletir diferenças importantes nos desenhos dos estudos bem como as limitações amostrais. Todavia, o estudo de proliferação associado com as alterações genéticas, como a LOH, constituem importantes passos na elucidação do comportamento biológico das leucoplasias.

7. CONCLUSÕES

A partir da análise dos dados, pôde-se concluir que:

1. A LOH dos marcadores de microssatélites das regiões cromossômicas 3p, 9p, 11p, 11q e 17p foi um evento identificado nas amostras de LB; 2. Os marcadores localizados no braço curto do cromossomo 9 (D9S157,

D9S162, D9S171) apresentaram maior frequência de perda alélica nas amostras estudadas;

3. O aumento da porcentagem da FAL foi identificado nas amostras que apresentaram displasia epitelial acentuada e nos carcinomas;

4. A LOH dos marcadores D9S162, D9S171 e P53 apresentou associação com alterações citológicas e arquiteturais do epitélio das LB.

5. Os dados moleculares de LOH não foram associados aos dados clínicos dos pacientes;

6. A imunopositividade da proteína p53 apresentou associação com a presença de alterações do tamanho nuclear do epitélio das displasias. Tendo em vista a complexidade dos processos relacionados com o comportamento biológico das leucoplasias bucais, assim como a dos fenômenos que norteiam a gênese do câncer de boca, mais estudos são necessários para melhor compreensão da etiopatogênese dessas lesões.

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