Sett i fra et prosessperspektiv

4.5.1.1. Microfiltração dos Caldos de Cultivo Contendo Soro de Queijo

A etapa de microfiltração foi realizada em todos os caldos fermentados provenientes de cultivos em biorreator. Serão apresentados três diferentes ensaios para ilustrar a aplicação da técnica e a reprodutibilidade do método. Tanto a atividade enzimática como a concentração de proteínas foram medidas antes e após o procedimento. Os resultados referentes a essa etapa estão apresentados na Tabela 4.38.

Tabela 4.38: Valores de atividade enzimática (AE) e concentração de proteínas (Cproteínas) medidas em caldo conendo PGA produzida por Bacillus megaterium, pelos métodos de Lowry e Bradford, antes e depois da etapa de microfiltração.

AE (UI/L) Cproteínas – Lowry (g/L) Cproteínas – Bradford (g/L) Ensaio

Inicial Final Inicial Final Inicial Final

1 208 203 2,37 2,29 0,54 0,49

2 224 220 2,48 2,57 0,46 0,52

A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Lowry, que dosa aminoácidos e peptídeos, e método de Bradford, que quantifica apenas peptídeos de massa molecular acima de 5000 Da. Desta forma, quando se observa uma diminuição na concentração de proteínas dosadas pelo método de Bradford, esta deve estar relacionada com a perda da enzima ou das proteínas do soro de queijo presentes no meio de cultivo, pois o meio de cultivo é constituído de aminoácidos e soro de queijo.

A microfiltração permitiu eliminação completa da suspensão de células, com preservação total da atividade enzimática em todos os ensaios avaliados, tal como pode ser observado na Tabela 4.38. A recuperação da enzima ao final do processo e os resultados similares para as os diferentes ensaios mostram que a técnica foi satisfatória para o objetivo proposto. Desta maneira, a partir do caldo livre de microrganismos iniciaram-se os processos de purificação e concentração propriamente ditos.

4.5.1.2. Ultrafiltração dos Caldos de Cultivo Contendo Soro de Queijo Integral

O permeado da microfiltração, foi então, submetido à concentração em membrana com curva de corte de 50 kDa e pressão de trabalho de 1,5 kgf/cm2.

Como o objetivo da ultrafiltração é obter um extrato enzimático concentrado, torna-se necessário estabelecer um fator de concentração volumétrica. O volume inicial de caldo microfiltrado era então submetido à ultrafiltração até que o retentado fosse diminuído a um volume 10 vezes menor que o volume inicial, estabelecendo um fator de concentração volumétrica igual a 10. Como nessa etapa as biomoléculas maiores que o poro da membrana ficam retidas e o volume torna-se reduzido, além da concentração da enzima, ocorre também a concentração das proteínas presentes no soro de queijo.

A eficiência do processo foi avaliada pela medida das concentrações de enzimas e proteínas antes e após a ultrafiltração. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 4.39.

A observação da Tabela 4.39 mostra que a ultrafiltração conduziu a um fator de concentração de 8,77 para atividade enzimática num caldo com fator de concentração volumétrica igual a 10. O fator de concentração das proteínas dosadas por Bradford, 9,08, próximo ao da atividade enzimática, mostra que não ocorreu desnaturação da enzima e que a diferença entre o fator de concentração volumétrico e o de ativiade enzimática possivelmente se deve a adsorção de proteínas, incluindo PGA na membrana. Essa técnica permitiu assim não somente concentrar a enzima, mas também conduziu a um fator de purificação de 2,8

vezes, devido à eliminação parcial das proteínas do soro com massa molecular menor que 50 kDa.

Tabela 4.39: Valores de atividade enzimática (AE) e concentração de proteínas (Cproteínas) obtidos de caldos de cultivo ultrafiltrados em membrana de 50 kDa com fator de concentração volumétrica igual a 10. Amostra AE (UI/L) FC Cproteína (g/L)a FC Cproteína (g/L)b FC AEespecífica (UI/gproteína)c FP Inicial 220 2,57 0,52 85,60 Final 1930 8,77 8,03 3,13 4,72 9,08 240,35 2,81 a

Concentração de proteínas dosada pelo método de Lowry;

b

Concentração de proteínas medida pelo método de Bradford F.C = Fator de concentração

F.P = Fator de purificação (atividade específica final/atividade específica inicial)

c

Proteínas medida pelo método de Lowry na atividade específica

A não desnaturação da enzima deve-se ao cuidado em manter o caldo em banho de gelo durante o processo de filtração, já que a baixa temperatura é condição primordial para evitar perdas na atividade enzimática por desnaturação da enzima, conforme verificado por Pinotti, 2003.

Com relação ao baixo fator de concentração obtido na dosagem de proteínas pelo método de Lowry este já era esperado, uma vez que aminoácidos e oligopetídeos contidos no meio de cultivo conseguem permear a membrana de ultrafiltração.

4.5.1.3. Diafiltração dos Caldos de Cultivo Contendo Soro de Queijo Integral

A diálise permite a retirada de solutos de baixa massa molecular e retenção das moléculas protéicas. O caldo concentrado na etapa de ultrafiltração foi submetido à diafiltração com cinco volumes de lavagem, utilizando como solução dialisante tampão fosfato 100 mM, pH 8,0. Resultados dessa operação estão apresentados na Tabela 4.40.

Tabela 4.40: Valores de atividade enzimática (AE) e concentração de proteínas (Cproteínas) antes e depois da diafiltração com tampão fosfato pH 8,0, 100 mM.

Amostra AE (UI/L) Cproteínas – Lowry (g/L) Cproteínas – Bradford (g/L) AEespecífica (UI/gproteína)* F.P Inicial 1930 8,03 4,72 240,35 Final 1490 2,62 3,18 568,70 2,37

F.P= Fator de purificação (atividade específica final/atividade específica inicial) *Proteínas medida pelo método de Lowry na atividade específica

A redução da concentração protéica mostra que está ocorrendo uma parcial purificação do caldo, como era o desejado. Contudo, observa-se um decréscimo de aproximadamente 23% na atividade enzimática. Esses resultados estão coerentes com os relatados por Balasingham et al.,1972, que apresentam uma perda de 24% na atividade recuperada após a diálise. Essa perda deve ser devido à retirada de pequenas moléculas presentes no meio de cultivo que interagem com a enzima e auxiliam-na a proteger a sua estrutura terciária, bem como adsorção de PGA na membrana. Esse último fator deve ser reduzido ao se operar em grande escala e não é preocupante.

4.5.2. Procedimentos de Concentração e Purificação para Enzima Produzida em Meio de