Assim, o primeiro objectivo do presente trabalho consistiu em determinar qual é o canal responsável pelo efeito da insulina nas correntes de K+ de neurónios piramidais isolados da zona CA1 do hipocampo de ratos wistar. Como já anteriormente descrito, a insulina induz uma redução da corrente de K+ nestes neurónios, sendo este efeito específico para a componente lenta da corrente (Islow). Sugerido por trabalhos anteriores, dois canais-candidato foram
testados, os canais Kv1.3 e os canais ERG.
Para se testar a hipótese dos canais Kv1.3, realizou-se primeiramente um estudo sobre o efeito da margatoxina (MgTx), inibidor selectivo de canais Kv1.3. As experiências foram realizadas em neurónios provenientes de animais no estado de pós-prandial. Verificou-se que o efeito da MgTx é específico para a componente Islow das correntes de K
+
, sendo este efeito proporcional à concentração de MgTx adicionada. Variando de uma redução quase nula para uma concentração de MgTx de 100fM, a uma redução de cerca de 30%, quando a concentração adicionada de MgTx era de 3nM. Ajustando-se uma função de Hill à relação dose-resposta, obteve-se um EC50 de 125pM. O valor encontrado para este parâmetro na
literatura (Coetzee et al., 1999) é de 230pM, valor na mesma ordem de grandesa. No entanto é possível que os canais em neurónios de hipocampo denotem uma maior sensibilidade dos Kv1.3 à MgTx.
Foi ainda estudado o efeito da MgTx sobre o comportamento das correntes de K+ em função da voltagem. Mais uma vez, verificou-se que a acção da MgTx é específica para a componente Islow das correntes dos canais K
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dos neurónios em estudo. Este facto assinala-se pela subtracção realizada às correntes antes e depois da adição da toxina, sendo o decaimento da corrente resultante passível de ser ajustada com uma função mono-exponencial, confirmando deste modo que a componente rápida (Ifast) não é afectada pela MgTx. Após o
ajuste com uma função mono-exponencial à fase inactivante da curva, obteve-se um τinact entre
os 600 e os 1000ms, estando estes valores aproximados daqueles registados para outros modelos (Coetzee et al., 1999).
Com vista a se obter informação referente ao modo de acção desta toxina de escorpião no canal, a partir dos perfis de voltagem (relação corrente-voltagem), foram calculados os V1/2
respectivamente. Estes resultados apontam no sentido de haver uma diferença significativa, nomeadamente uma deslocação para valores 11mV mais despolarisados no perfil de activação dos canais Kv1.3, depois de adicionada a MgTx. Assim, a MgTx deve actuar no ‗sensor de voltagem‘ de modo a que a activação do canal fique menos sensível à activação pela voltagem. Estas observações alargam o entendimento sobre o modo de acção desta toxina e sobretudo no seu efeito em neurónios da região CA1 do hipocampo, uma vez que, até à data só se conhecia o papel facilitatório da MgTx na excitabilidade através de estudos de current-
clamp executados em culturas de hipocampo (Kupper, et al., 2002). Igualmente, não se
conhecia a sensibilidade deste antagonista em modelos neuronais.
Por outro lado, foi também estudado o efeito da insulina na presença de MgTx, de modo a se determinar se, de facto, seria o Kv1.3 o canal responsável pelo efeito da insulina nas correntes de K+ de neurónios isolados da zona CA1 de hipocampo de ratos. Estas experiências foram realizadas em ―neurónios em pós-prandial‖, uma vez que, resultados do nosso laboratório apontam que no estado de jejum a insulina não surge efeito.
Esta abordagem foi de alguma forma condicionada pelo facto de o efeito provocado pela MgTx não ser reversível com a lavagem. Assim, adicionaram-se concentrações variáveis de MgTx, e depois de estabilizado o efeito da mesma, eram adicionados 300nM de insulina. Verificou-se que, embora a concentrações pequenas de MgTx a insulina inibia claramente Islow,
nomeadamente às concentrações de 10pM e de 100pM, a concentrações mais significativas, o efeito da insulina tendia a diminuir, até ser quase nulo a uma concentração de MgTx de 3nM. Se compararmos a relação da % inibição em Islow / dose de MgTx com o efeito da insulina (a 300nM) (% de inibição) em função do pré-tratamento com diferentes doses de MgTx (Figura 5.1), verifica-se uma relação reveladora.
Figura 5.1- Análise comparada dos resultados obtidos para o efeito da insulina na presença de MgTx em células isoladas da região CA1 do hipocampo de ratos wistar. Legenda: efeito MgTx; efeito da Ins na presença de MgTx; barras- erro padrão. % de inibição em Islow com 300nM de insulina na ausência de MgTx (Lima, et al.,
2008). É notória uma diminuição do efeito da insulina à medida que o efeito e a concentração de MgTx aumentam.
A Figura 5.1 demonstra que o efeito da insulina depende de uma forma inversamente proporcional ao efeito e concentração de MgTx, ou seja, quanto maior for a inibição com MgTx (dependente da sua concentração), menor é o efeito da aplicação consequente de insulina. Há que relembrar aqui que, tratando-se de registos em configuração de whole-cell, tem-se o somatório de várias correntes. Se a insulina exerce a sua acção através de outros canais para além dos Kv1.3, esperar-se-ia que o efeito da insulina se mantivesse na presença de MgTx. Como a MgTx está a bloquear os canais Kv1.3, sugere-se que a insulina actua sobre estes mesmos canais, uma vez que quando estes estão bloqueados, a insulina não provoca qualquer efeito sobre as correntes de K+. Resumindo, sendo a MgTx um inibidor selectivo dos canais Kv1.3, estes resultados sugerem que estes canais de K+ medeiam a corrente sensível à insulina em neurónios piramidais da zona CA1 do hipocampo.
De qualquer modo, há a considerar a possibilidade da insulina actuar também em outras correntes de K+, nomeadamente aquelas mediadas por canais ERG. Esta hipótese era plausível uma vez que os canais ERG formam correntes funcionais nos neurónios CA1 do hipocampo (Alves, et al., em preparação) e são subjacentes à corrente sensivel à insulina em células diferenciadas de neuroblastoma N1E-115 (Lima, et al., 2008). Sendo os canais ERG caracterizados por induzirem correntes de K+ inward, o estudo foi realizado com uma solução extracelular de concentração de K+ elevada. Por estudos realizados no nosso laboratório, verificou-se que após a adição de insulina, não havia redução da corrente despoletada pelos canais ERG, levando a concluir que não são estes os canais responsáveis pelo efeito da insulina nestes neurónios.