State of the Art
2.5 Neuro-Fuzzy – A Hybrid-Intelligence Analytics
2.5.3 Self-Organizing Map Configuration 34
Os principais objectivos desta tese residiram na contribuição para uma melhor compreensão dos mecanismos de reconhecimento molecular associados a duas proteínas codificadas no operão de metabolização de arabinose presente na Bacillus subtilis.
Relativamente à AraN, através de estudos de STD-RMN foi possível aferir que a subunidade procedente à subunidade redutora em arabinoligossacáridos apresenta um papel fulcral no reconhecimento dos mesmos. Por um lado, é esta a subunidade que apresenta um maior grau de saturação ao longo do estudo da série de interações AraN-arabinoligossacáridos (de duas a quatro subunidades). Por outro lado, o facto da arabinose não apresentar STD contrariamente ao observado para a arabinobiose, pode ser indicativo de que a adição de uma segunda subunidade é fundamental no estabelecimento de interações com a AraN. Através de um modelo de homologia da AraN, foi possível efetuar dockings moleculares para a arabinotriose. A análise destes modelos permitiu por uma lado tirar conclusões acerca dos resíduos da proteína que se encontram a interagir com a arabinotriose, e por outro lado aferir que regiões da arabinotriose se encontram hipoteticamente em maior proximidade com a AraN. O processo de reconhecimento, tal como previamente observado noutras SBP, é governado por um conjuntos de resíduo que irão estabelecer interações com grupos – CH do arabinoligossacárido, através do stacking de cadeias laterias aromáticas nos anteriores. Na AraN estes resíduos são o Y54, W253 e Y254, sendo que destes o resíduo W253 é conservado nesta família de proteínas encontrando-se a envolvido no processo de reconhecimento molecular dos substratos em questão. As cadeias laterias destes três aminoácidos parecem estar a interagir com as três subunidades que compõem a arabinotriose, de um modo singular na medida que cada cadeia lateral parece apenas interagir com um monómero (1 para 1). O facto da maior amplificação de STD ser conseguida com a arabinotriose, pode ser indicativo de que o local de ligação está optimizado para o reconhecimento de oligosacáridos compostos por três subunidades, algo que vai ao encontro do facto do local de ligação se encontrar decorado pelo três resíduos aromáticos acima evidenciados. Para além das interações em cima mencionadas, um dos modelos de docking também previa a formação de pontes de hidrogénio entre as subunidades redutoras e não redutoras com a AraN através dos resíduos E175, D178 e E78 respectivamente.
Uma das principais inconsistências dos estudos efectuados por STD-RMN está associada a fenómenos de relaxação longitudinal T1. Tal como é ilustrado na literatura [98], estes carbohidratos
apresentam algumas variações de T1 associadas aos diferentes protões que o compõem, variações
estas que podem ter implicações na determinação inequívoca de um modo de ligação através do mapeamento de epítopos, pois num determinado tempo de saturação, os efeitos de relaxação não irão ser iguais para os diferentes protões podendo ocorrer uma subvalorização ou sobrevalorização da interação caso o seu T1 seja inferior ou superior ao tempo de saturação respectivamente. A
determinação de um parâmetro STDfit, este último determinado em condições nas quais os efeitos de
T1 são negligenciáveis, originou um mapeamento diferente na medida que o protão H4α da
subunidade redutora apresenta maior grau de saturação. Este dado poderá fazer sentido, visto que no modelo de docking, o protão que está em maior proximidade com a AraN é o H4α. A melhor
maneira de aferir o impacto que as relaxações longitudinais podem ter no mapeamento de epítopos, é através do calculo do T1 de cada protão através de uma experiencia de inversion recovery.
Com recurso à técnica de STD-RMN, foi ainda possível constatar que afinidade da AraN não é tão grande quanto o reportado para outras SBP’s, visto que a primeira está na ordem dos 200 a 700 µM, ao passo que as segundas apresentam um Kd na ordem de 1 a 10 µM. Por outro lado a AraN não é apenas especifica para arabinoligossacáridos. Em condições de competição a arabinotriose parece competir com a celotetraose para o mesmo local de ligação. O facto de se verificar esta competição ao nível da AraN que se encontra envolvida num transportador dedicado ao importe de arabinoligossacáridos, pode ser uma forma de repressão catabólica exercida diretamente ao nível do transportador. Em Bacillus subtilis, é conhecida a existência de um transportador dedicado ao transporte de celobiose codificado ao nível do operão lic. De um ponto de vista biológico e metabólico a incorporação de celoligossacáridos pode ser energeticamente mais favorável, assim em condições de competição os celoligossacáridos constituídos por unidades monoméricas de glucose irão funcionar como fonte de carbono primária. Uma maneira de verificar esta hipótese seria através da medição do transporte destas fontes de carbono marcadas isotopicamente em condições de competição, nas quais um dos carbohidratos é marcado e o segundo não, e subsequente determinação da sua localização sub-celular. Por outro lado, o facto da maltohexaose não competir com a arabinotriose pode estar associado a mecanismos estereoespecíficos ou face ao seu tamanho. Para se perceber melhor os motivos pelos quais a celotetraose compete com a arabinotriose ao contrario da maltohexaose é necessário efetuar experiencias de competição com oligossacáridos com igual tamanho (arabinotriose, celotriose, maltotriose).
Os estudos in silico, nomeadamente através de docking molecular e alinhamentos, serviram como foi em cima indicado, para estabelecer resíduos putativos de se encontrarem a interagir ao nível do local de ligação da AraN, e em geral para estabelecer um modo de reconhecimento arabinotriose-AraN. Face à abertura da cavidade de ligação, foram observados essencialmente dois polos nos quais se encontram resíduos passiveis de estarem envolvidos no estabelecimento de interações com a arabinotriose. Para tal foram efectuados dois mutantes R81A e W253A, sendo que este último ainda não foi testado. Através de STD-RMN, não se verificou alterações no que toca ao padrão de reconhecimento da arabinotriose quando comparado com o padrão efectuado com a AraN(wt). Assim, é essencial analisar por um lado quais as implicações de um estudo semelhante ao nível da AraN(W253A) e da AraN(W253A e R81A), para perceber se a mutação no primeiro leva à abolição completa do reconhecimento da arabinotriose, ou no segundo se o processo de reconhecimento é cooperativo, isto é, se o processo de reconhecimento envolve ambos os resíduos que por um lado se encontram a estabelecer interações de diferentes naturezas, hidrofóbicas no caso do W253 e polares no caso do R81, e por outro lado visto que se encontram localizados em lobos diferentes da AraN. Ainda relativamente aos estudos in silico, estes foram efectuados sem que o receptor molecular tivesse mobilidade, e tendo em conta que associado ao processo de reconhecimento molecular está a deslocação do domínio N-terminal e fecho sobre o local de ligação, é também essencial mimetizar esta condição através da modelação de um docking com o receptor molecular móvel.
Para além da proteína AraN (SBP), um dos objectivos da tese era o de estudar os mecanismos de reconhecimento molecular nível sobre o ponto de vista da fosfatase AraL. Visto que esta proteína era sobrexpressa inicialmente sobre a forma de corpos de inclusão foi desenvolvida uma metodologia com recurso a SDS para solubilizar esta proteína, sendo que o detergente é posteriormente precipitado com 150mM de KH2PO4 e a proteína extraída com 0,1% de Sarkosyl.
Futuramente a renaturação desta proteína pode ser aferida com recurso à aquisição de um espectro de HSQC, e a sua atividade com recurso a uma titulação com um substrato fosforilado.