No planejamento experimental os ensaios foram realizados com um volume pequeno (em torno de 10mL), para garantir a não interferência da amoxicilina nos resultados, pois esta está presente no comprimido utilizado juntamente com o ácido clavulânico em quantidade 4 vezes superior ao AC. Embora tenha-se desenvolvido um método com ótimos resultados para se obter o AC puro a partir do comprimido (discutido anteriormente em maiores detalhes nos tópicos 5.5.3 – Precipitação do AC com o 2-etilexanoato de potássio – ensaios preliminares, e 5.5.2 – Extração do ácido clavulânico em diferentes solventes),
(c) 6,6 10 15 20 23,4 Co n c. d e A C (m g /m l ) 0,33 0,5 0,75 1 1,17 V a z ão d e am ina (got a/ m inu to)
verificou-se que para se trabalhar com volumes maiores na etapa de precipitação (cerca de 50mL) era necessário partir de quantidades iniciais de comprimidos muito superiores às utilizadas naqueles ensaios. Por exemplo: para se obter uma concentração de AC de 20mg/mL em 50mL de solvente orgânico é necessário partir de uma quantidade inicial de AC de aproximadamente 2250mg (que equivale a quantidade de 18 comprimidos), para se realizar apenas um único experimento. Na reação R2 na qual a existem valores de concentrações de sal
de amina do AC superiores a 20mg/mL a quantidade necessária de comprimidos é bem maior. Traços de amoxicilina poderiam ser encontrados se a quantidade de comprimidos aumentasse muito, pois como verificado o acetato de etila apesar de seletivo para o AC ainda carrega mesmo que seja um mínimo de amoxicilina que quando presente em maior quantidade poderia estar aí sim interferindo nas reações de precipitação para o AC.
Assim para os ensaios realizados com volume de 50mL foi utilizado o AC proveniente da amostra clavulanato/celulose. Foram realizados três ensaios nas mesmas condições empregadas para o ensaio 11 do DCCR.
Os rendimentos encontrados para o sal de amina do AC precipitado, foram de 93,56, 97,51 e 94,89% e a média destes de 95,32% (± 1,64), ligeiramente superior ao observados para o ensaio 11 (93,57%), validando experimentalmente os resultados obtidos no planejamento completo.
5.5.2.2 Ensaio para o caldo de fermentação
Depois de concluído o planejamento fatorial, foi realizado um experimento para o caldo de fermentação, utilizando as mesmas condições do ensaio 11 (DCCR), pois esse ensaio apresentou uma das melhores respostas para o rendimento (93,57 %).
O rendimento obtido nessa etapa foi de 80,21 %. O espectro de RMN (Figura 5.5.10) mostrou que não há presença significativa de outras substâncias (impurezas), na amostra analisada. Porém, outras substâncias ainda presentes no caldo de fermentação, como pigmentos, podem ter interferido em pequena escala na reação de precipitação do sal de amina do AC, mas sem terem precipitado juntamente com ele. Isto demonstra que a reação R1 com a
t-octilamina possui maior seletividade quando comparada a R0 (reação direta), (pois nessa
última uma grande quantidade de impurezas precipitou juntamente com o clavulanato de potássio), promovendo uma purificação através da formação do intermediário estável.
O sal de amina do AC precipitado a partir do caldo de fermentação ainda foi comparado com o sal de amina obtido no ensaio 11 (a partir do Clavulin) do planejamento fatorial (Figura 5.5.11). Observou-se, a partir da comparação desses dois espectros de RMN-
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H, que não há entre os dois experimentos diferença significativa quanto à pureza dos precipitados obtidos (sal de amina do AC). Dessa maneira pôde-se comprovar a grande seletividade da reação com a t-octilamina para o AC presente no caldo de fermentação e a importância da utilização do planejamento fatorial para designar as melhores condições, nas quais essa reação de precipitação possa ocorrer com elevado rendimento.
Figura 5.5.10– Espectro de RMN -1H do sal de amina do AC precipitado do caldo de fermentação a partir da reação do AC com a t-octilamina, utilizando as mesmas condições do
Figura 5.5.11 – Espectro de RMN -1H do sal de amina do AC precipitado do Clavulin a partir da reação do AC com a t-octilamina para o ensaio 11 do planejamento fatorial.
O sal de amina de AC precipitado do caldo de fermentação mostrou-se muito estável e não higroscópico.
A forma dos cristais obtidos nessa reação para o caldo de fermentação foi verificada a partir de fotos de microscopia eletrônica (Figura 5.5.12).
(a) (b)
Figura 5.5.12 - Fotomicrografias para o ensaio com o caldo de fermentação, obtidas utilizando-se Sistema SE: (a) com ampliação de 250X; (b) com ampliação de 1000X.
Pela Figura 5.5.12 observou-se que os cristais do sal de amina de AC precipitados a partir do caldo de fermentação apresentavam-se na forma de plaquetas e pouco aglomerados.
Ainda foi realizada uma comparação desses com os cristais de amina obtidos do caldo de fermentação com os obtidos anteriormente no planejamento fatorial a partir do Clavulin. As fotomicrografias (Figura 5.5.13) foram obtidas em MEV, utilizando-se uma ampliação de 800X.
Figura 5.5.13 – Fotomicrografias para o ensaio 11 (DCCR) obtidas utilizando-se Sistema SE com ampliação de 800X.
Observando a Figura 5.5.13 nota-se que os cristais de sal de amina do AC obtidos para o ensaio 11 (DCCR) a partir da amostra de Clavulin, são mais bem formados e não há sinais de aglomeração. Desse modo acredita-se, que as impurezas ainda presentes no caldo de fermentação possam ser as responsáveis pela diferença na formação dos cristais observados.
A escolha da t-octilamina revelou ser muito adequada para a reação indireta com o AC, e os resultados encontrados foram excelentes, dentro das condições estudadas.
Através do planejamento experimental utilizado conseguiu-se otimizar a reação e ainda verificou-se que esta ocorre satisfatoriamente sob condições mais extensas do que para a reação direta (R0), propiciando sua utilização em escala industrial. Foi observado ainda que
não houve a formação de incrustação, de óleo ou soluções coloidais indicando uma grande estabilidade do intermediário formado (sal de amina do AC). Quanto à toxicidade da t- octilamina, a literatura indica que não há formação de intermediários tóxicos para essa reação (YANG et al., 1994).
Para o caldo de fermentação o uso da reação indireta promoveu ainda uma purificação e propiciou que altos rendimentos fossem obtidos a partir de baixas concentrações iniciais de AC no caldo.