1 Innledning
1.2 Sammenheng mellom økonomiske forhold og studieprogresjon?
Com base na avaliação da dose-resposta da Cetamina foi selecionada a dose 5,0 mg / kg da droga visando observar o efeito reversão dos efeitos do quando tratados com Cetamina neonatal.
4.5.4. Tratamento de reversão
Os animais adultos, machos e fêmeas, receberam como tratamento de reversão a Clozapina (antipsicótico atípico) 10mg/kg via intraperitoneal ou solução salina durante 10 dias. O teste de IPP foi realizado no décimo primeiro dia, assim como o teste Y-maze. Após, as determinações comportamentais, os ratos foram sacrificados por decapitação e o PF, HC e CEE e CED dissecados e armazenados a -70 ºC até a determinação dos testes neuroquímicos.
Protocolo I
Figura 8. Curva Dose-Resposta para Cetamina 2,5 e 5,0mg/kg.
0 7 11 35 65 Tempo (Dias) Tratamento c/ Cetamina 2,5 e 5mg/kg Comportamental Avaliação (IPP e Y-maze) Avaliação Comportamental (IPP e Y-maze) Nascimento
Protocolo II
Figura 9. Determinação das alterações neuroquímicas induzidas por Cetamina
Protocolo III
Figura 10. Determinação do efeito da Clozapina na reversão das alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas por Cetamina.
Tratamento de Reversão 0 66 75 76 Tempo (Dias) Inicio do Tratamento c/ Clozapina 10mg/kg 1x ao dia i.p. Término do Tratamento c/ Clozapina 10mg/kg Testes comportamentais e Neuroquímicos Nascimento
4.6. Testes de comportamento e neuroquímicos realizados
4.6.1. Teste de Inibição Pré-pulso
Inibição Pré-Pulso (IPP) é caracterizada pela redução do reflexo de sobressalto a um estímulo acústico intenso (pulso), quando imediatamente precedido por um estímulo de menor intensidade (pré-pulso). A reação corporal dos roedores a um estímulo acústico será monitorado em uma câmara (INSIGHT equipamentos científicos – Brasil modelo EP-175) conectada a um tubo (diâmetro 8,2 cm, comprimento 20 cm) montada em uma caixa fechada ventilada será utilizada.
Os animais serão colocados em um contensor (4,5 × 5,0 × 5,5 cm) consistindo de barras de aço inoxidável de 3,0 mm de diâmetro com espaçamento de 0,8 centímetros de distância. O contensor será mantido preso sobre uma balança, chamada plataforma de resposta, através de quatro parafusos. Um alto-falante localizado a 15 cm do contensor será usado para fornecer os estímulos de pulso, pré-pulso e ruído de fundo. O contensor, a plataforma e o alto-falante serão localizados dentro de uma câmara acústica ventilada (64 × 60 × 40 cm). Procedimentos de calibração serão realizados antes dos experimentos para garantir sensibilidades equivalentes das plataformas de resposta ao longo do período de teste.
A sessão de testes começa ao se colocar um animal no contensor para a aclimatação, que consiste em uma exposição de 5 minutos ao ruído de fundo (65 dB). Após o período de aclimatação os camundongos serão apresentados a uma série de 10 estímulos de treino (pulso sozinho - 120 dB, 50 ms de duração), com um ensaio de inter-intervalo de 20s. O objetivo desta fase será permitir a habituação da resposta de sobressalto do animal. Posteriormente, a modulação IPP de sobressalto será testada no seguinte protocolo: 74 ensaios pseudorandomizados divididos em oito categorias diferentes, apresentados com um intervalo inter-estímulos de 20 s: 20 apresentações de pulso sozinho (120 dB, 50 ms de duração), 8 apresentações de cada intensidade de pré-pulso sozinho (70,75 e 80 dB, frequência 3000 Hz, 20 ms de duração), 10 apresentações de cada intensidade de pré-pulso
+ intensidade de pulso (com intervalo de 50ms entre pré-pulso e pulso) e ausência de estímulo, nesse bloco o animal só recebe o estímulo de ruído de fundo (adaptado de Gururajan et al., 2010).
A média da amplitude de resposta de sobressalto aos ensaios de pulso sozinho (P) e pré-pulso + pulso (PP + P) serão calculados pelo software para cada animal. O nível de IPP em cada camundongo será definido como a porcentagem da redução da amplitude do sobressalto nos ensaios de PP + P em comparação com a amplitude do sobressalto nos ensaios de P, de acordo com a seguinte fórmula: % PPI = 100 - [100 × (PP + P / P)]. Usando esta fórmula, um valor de IPP de 0% denota que não houve diferença entre a amplitude da resposta de sobressalto do pulso sozinho e do pré-pulso + pulso, consequentemente, não houve IPP (LEVIN et al., 2011). Espera-se que o grupo de animais administrados apenas cetamina apresentem déficits neste teste comportamental.
4.6.2 Teste labirinto em Y (Y-maze)
A memória operacional (working memory) e o aprendizado foram avaliados pela taxa de alternações espontâneas em um labirinto em Y (Figura 11) com os três braços (40 x 5 x 16 cm) posicionados em ângulos iguais como descrito anteriormente por SARTER et al., (1988). Antes do teste, os braços foram numerados, o animal foi então, colocado em um braço e alternou espontaneamente as entradas nos outros durante 8 minutos. A seqüência dos braços os quais os animais entraram foram então anotadas e as informações analisadas de forma a determinar o número de entradas no braço sem repetição.
Uma alternação foi considerada correta se o animal visitou um novo braço e não retornou aos dois braços anteriormente visitados. Assim, a percentagem das alternações foi calculada como a razão entre as alternações corretas (n) e o número de visitas realizadas durante o período de observação (n-2), multiplicado por 100.
O sucesso do teste é indicado pela alta taxa de alternância nos grupos controle, indicando que os animais podem se lembrar em qual braço eles entraram por último. Entre cada sessão, o labirinto foi higienizado com uma solução de álcool a 20% e secado com toalhas de papel.
Figura 11. Y-maze
Fonte: http://www.ratbehavior.org/RatsAndMazes.htm Acesso: 08.07.2012
4.6.3 Testes Neuroquímicos
Conforme citado anteriormente, os testes neuroquímicos realizados foram GSH, BDNF nos animais tratados com cetamina 5mg/kg e no tratamento de reversão pela Clozapina.
4.6.3.1 Preparação de tecido
As amostras de tecido cerebral foram homogeneizadas (10 vezes (w/v) arrefecidas com gelo, com 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4). Os homogenatos foram centrifugados a 10.000 rpm durante 15 minutos, e alíquotas dos sobrenadantes foram separados e usados para a determinação dos parâmetros de estresse oxidativo.
4.6.3.2 Determinação de Glutationa Reduzida (GSH)
Os níveis de Glutationa Reduzida foram avaliados para estimar defesas endógenas contra o estresse oxidativo. O método é baseado na reação de reagente de Ellman (DTNB), com grupos tiol livres. As áreas do cérebro foram diluídas em tampão de 0,02 M de EDTA (10% w / v) e adicionadas a uma solução de ácido tricloroacético a 50%. Após centrifugação (3000 rpm/15 min), o sobrenadante do homogeneizado foi recolhido e os níveis de GSH foram determinados (Sedlak e Hanus, 1982). E então, as amostras foram misturadas com 0,4 M de tampão tris-HCl, pH 8,9 e 0,01 M de DTNB. Níveis de GSH foram determinados por espectrofotometria a 412 nm, calculada com base numa curva padrão de glutationa e expressos como ng de GSH / g de tecido úmido.
4.6.3.3 Níveis de Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF)
Após homogeneização das áreas cerebrais a 20 volumes de tampão PBS pH 7,4 foi adicionado inibidores de protease (Sigma-Aldrich), o nível de BDNF de cada amostra foi quantificado por ensaio imunoenzimático (ELISA; R&D Systems, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram expressos em picograma de BDNF/ mg de proteína total determinada pelo método de Lowry (1951).
4.7 Análise estatística
O software utilizado para análise dos dados foi o GraphPad Prism versão 5.0 para Windows, GraphPad Software (San Diego, CA, EUA).
Os resultados dos estudos comportamentais foram expressos como a média ± EPM (erro padrão da média) da porcentagem de IPP e Y-maze. Os dados de IPP foram analisados com ANOVA duas vias tendo o tratamento farmacológico e o tempo como parâmetros, seguido pelo teste de Bonferroni. O Y-maze . ANOVA de uma Via seguida do teste de Bonferroni.
Os resultados dos estudos neuroquímicos foram expressos em média ± erro padrão da média (EPM) e foram analisados com ANOVA de uma Via seguido por um teste de Student-Newman-Keuls. Para todas as análises, o nível de significância foi p< 0,05.
5. RESULTADOS
5.1. PROTOCOLO I – CRITÉRIO DE FACE (AVALIAÇÃO DO EFEITO DOSE- RESPOSTA DA CETAMINA PARA A INDUÇÃO DO MODELO NEURODESENVOLVIMENTAL DE ESQUIZOFRENIA)
5.1.1 Alterações comportamentais - IPP
A análise dos dados do teste de Inibição pré-pulso por ANOVA duas vias em animais adolescentes machos e fêmeas (Fig. 10 A e B) tratados com cetamina neonatal mostrou efeito significativo do tratamento (machos- [F(2, 32)= 5,38 , P= 0,0164], fêmeas- [F(2, 36)= 3,66, P= 0,0463]) e intensidade de pulso (machos- [F(2, 32)= 12,93, P< 0,0001], fêmeas- [F(2, 36)= 27,56, P< 0,0001]). A análise post hoc pelo teste de Bonferroni no período da adolescência (35 dias) em animais machos e fêmeas revelou um aumento significativo da IPP nos animais tratados com cetamina 2,5 mg/kg (P< 0,05) nas intensidades de pulso de 70 e 75 em comparação com animais controle, não havendo alterações significativas nos animais tratados com cetamina 5 mg/kg.
A análise da IPP na fase adulta (65 dias) por ANOVA duas vias também mostrou efeito significativo do tratamento (machos- [F(2, 15)= 5,3, P= 0,0182], fêmeas- [F(3, 22)= 10,77, P= 0,0001]) e intensidade de pulso (machos- [F(2, 30)= 4,54, P= 0,0189], fêmeas- [F(2, 44)= 21,72, P< 0,0001]) em animais machos e fêmeas tratados com cetamina neonatal. O teste post hoc de Bonferroni revelou redução significativa (P< 0,05) da IPP nos animais machos tratados com cetamina 2,5 mg/kg na intensidade de pulso de 70 e nos animais tratados com cetamina 5 mg/kg nas intensidades de pulso de 70, 75 e 80 quando comparado ao controle. Nas fêmeas adultas ocorreu inversão significativa da IPP (P< 0,01) nos animais no período de diestro nas intensidades de pulso de 70 e 75 quando comparados aos animais controle, enquanto nos animais na fase de proestro ocorreu aumento significativo da IPP (P< 0,05) quando comparados aos animais na fase de diestro nas intensidades de 70, 75 e 80 (Fig 12 C e D).
Figura 12: Percentual de Inibição Pré-Pulso nos grupos adolescentes e adultos, machos e fêmeas tratados com cetamina de 2,5mg/kg e 5,0mg/kg no período neonatal (7º a 11º dia de nascidos.
Os resultados estão expressos como média ± EPM de 6 animais por grupo. ANOVA duas
vias seguida do teste de Bonferroni foram utilizados. aP< 0,05 quando comparado aos
respectivos controles; bp< 0,05 quando comparado aos animais tratados com Cet 2,5; cp< 0,05 quando comparados ao período de diestro (fêmeas).
5.1.2 Alterações comportamentais – Y-maze
A avaliação da memória de trabalho pelo teste de Y-maze no período da adolescência pelo teste de ANOVA de uma Via seguido de Bonferroni post hoc não revelou alterações significativas induzidas pelos tratamentos na memória dos animais (Figura 13 A e B).
Na idade adulta (65 dias), entretanto, ANOVA de uma Via mostrou interação significativa tratamento x porcentagem de alternâncias corretas nos animais machos - [F(2, 15)= 5,3, P= 0,0182]. A análise de Bonferroni nestes grupos revelou uma redução significativa (P< 0,001) no número de alternâncias corretas nos animais tratados com cetamina 5 mg/kg no período neonatal quando comparados ao controle (Fig 13 C). Nas fêmeas ocorreu efeito significativo do tratamento [F(2, 9)= 10,95, P= 0,0091] e intensidade de pulso [F(2, 18)= 11,02, P= 0,0007]. A análise post hoc revelou redução significativa do número de alternâncias corretas nas fases de diestro e proestro pelo tratamento com cetamina 5 mg/kg quando comparado aos animais controle (Fig 13D).
Figura 13: Percentual de Alternâncias corretas nos grupos adolescentes e adultos, machos e fêmeas nas doses de 2,5mg/kg e 5,0mg/kg de Cetamina administradas no período neonatal (7º a 11º dia de nascidos).
Os resultados estão expressos como média ± EPM de 6 animais por grupo. ANOVA de
uma Via seguida do teste de Bonferroni foram utilizados. ap< 0,05 quando comparado aos
5.2. PROTOCOLO II e III – CRITÉRIO DE CONSTRUCTO E VALIDADE PREDITIVA (AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES NEUROQUÍMICAS INDUZIDAS POR CETAMINA).
5.2.1 Determinação dos níveis de Glutationa Reduzida (GSH)
No CPF e no HP observou-se que o conteúdo de GSH diminuiu significativamente nos animais adultos machos tratados com Cetamina 5mg/kg quando comparados ao grupo controle CPF (Controle – 480,7 ± 25,6; cet 5 – 340,1 ± 18,7; ng/g de tecido). Essa alteração foi revertida no tratamento com a Clozapina 10mg/kg (536 ± 74). HP (Controle – 502,4 ± 28,1; cet 5 – 359,2 ± 23,3; cet 5 + cloz- 435,9 ± 13,8). (Figura 14A).
O conteúdo do GSH também diminuiu significativamente nos animais adultas fêmeas tratadas com Cetamina 5mg/kg na fase diestro no CPF (controle – 418,8 ± 28,3; cet 5 diestro – 306,1 ± 26 ng/g de tecido). Essa alteração foi revertida no tratamento com a Clozapina 10mg/kg (421 ± 17,39) em fêmeas na fase diestro. No HP também diminuiu significativamente nos animais adultas fêmeas tratadas com Cetamina 5mg/kg na fase diestro (controle – 593,5,8 ± 82,59; cet 5 diestro – 331 ± 5,7 ng/g de tecido). Essa alteração foi revertida no tratamento com a Clozapina 10mg/kg (500,7 ± 33) em fêmeas na fase diestro. Nas fêmeas na fase proestro tratadas, houve um aumento significativo de GSH quando comparado com fêmeas na fase diestro tratadas (Figura 14B).
Figura 14: Níveis de GSH no CPF e HP nos grupos adultos, machos e fêmeas tratados com 5,0mg/kg de Cetamina no período neonatal (7º a 11º dia de nascidos).
Cada barra representa a média ± EPM de 6-10 animais por grupo. a,b,cp<0,05 quando
comparado com animais controle, Cet 5 e Cet 5 diestro, respectivamente. ANOVA seguida por Student-Newman Keuls.
5.2.2 Determinação dos níveis do Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) No HP dos animais adultos machos tratados com Cetamina 5mg/kg houve aumento significante nos níveis de BDNF (-controle -248 ± 11; cet 5 – 293 ± 9,4; cet 5 + cloz -218,7 ± 10,83). Entretanto, nas fêmeas, tratadas com Cetamina 5mg/kg na fase diestro, foi observado uma redução significativa dos níveis de BDNF quando comparadas com o controle (controle -280,2 ± 13,84; cet 5 diestro – 205,8 ± 29,5; cet 5 proestro 240,9 ± 13,52 cet 5 diestro + cloz - 282,5 ± 12,66). Essa alteração foi revertida no tratamento com a Clozapina 10mg/kg em fêmeas na fase diestro (Figura 15).
Figura 15: Níveis de BDNF no HP nos grupos adultos, machos e fêmeas na dose de 5,0mg/kg de Cetamina administradas no período neonatal (7º a 11º dia de nascidos).
Cada barra representa a média ± EPM de 6-10 animais por grupo. a,bp<0,05 quando comparado com animais controle e Cet 5 diestro, respectivamente. ANOVA seguida por Student-Newman Keuls.
5.3 PROTOCOLO III – CRITÉRIO PREDITIVO (AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS INDUZIDAS POR CETAMINA - PREVENÇÃO E REVERSÃO POR CLOZAPINA)
A avaliação dos animais submetidos a administração de cetamina neonatal e tratados com clozapina na idades adulta no teste de IPP mostrou uma reversão do déficit de IPP induzido pela administração de cetamina neonatal, em todas as intensidades de pulso, quando comparado aos animais tratados com Cetamina 5mg/kg (Fig 16 A). Nas fêmeas, o tratamento com a Clozapina na fase de diestro reverteu a redução na IPP induzida pela administração de cetamina neonatal nas intensidades de pulso de 70dB e 75dB quando comparado aos animais tratados apenas com cetamina neonatal e avaliados na fase de diestro. Na fase do proestro houve também um aumento de IPP quando comparado aos animais controle (Fig 16 B).
Figura 16: Percentual de Inibição Pré-Pulso nos grupos adultos, machos e fêmeas na dose de 5,0mg/kg de Cetamina administradas no período neonatal (7º a 11º dia de nascidos).
Os resultados estão expressos como média ± EPM de 6 animais por grupo. ANOVA duas
vias seguida do teste de Bonferroni foram utilizados. aP< 0,05 quando comparado aos
controles adultos; b,cp< 0,05 quando comparado aos animais tratados com Cet 5 machos e
5.4 Níveis de Estrógeno
As fêmeas na fase adulta foram separadas por sua fase no ciclo estral. Para a confirmação da fase através da coleta no material vaginal, foi realizada uma análise dos níveis de estrógenos sanguíneos. Os níveis de estrógeno no diestro foram significativamente menores do que as fêmeas na fase Proestro (Proestro – 69 ± 4,7; Diestro – 43,9 ± 1,8).
Figura 17: Níveis séricos de estrógenos em fêmeas tratadas na dose de 5,0mg/kg de Cetamina administradas no período neonatal (7º a 11º dia de nascidos).
Proestro Diestro 0 20 40 60 80
a
N ív e is s é ri c o s d e E s tr a d io l (n g /m l)Cada barra representa a média ± EPM de 6-10 animais por grupo. ap<0,05 quando
6. Discussão
Os resultados do presente trabalho demonstraram que a administração neonatal de cetamina em ratos induz alterações comportamentais (i.e. déficit de inibição pré-pulso e alterações de memória de trabalho) e neuroquímicas (i.e. redução de GSH e BDNF) na idade adulta que guardam grande similaridade com as encontradas em humanos portadores deste transtorno metal, tendo sido ambas as alterações tratadas pela administração do antipsicótico atípico clozapina na idade adulta. Desta forma, este modelo se mostra importante como um modelo neurodesenvolvimental de esquizofrenia, permitido, por exemplo, o estudo de fármacos com potencial efeito preventivo e terapêutico, pelo fato de não terem sido manifestadas alterações significativas na adolescência dos animais, o que amplia as ferramentas disponíveis para o estudo deste tão complexo transtorno mental.
A esquizofrenia é um transtorno psiquiátrico grave e, talvez, por isso, um dos mais pesquisados, com importantes avanços sobre sua fisiopatologia no último século, embora até o presente momento com poucos benefícios evidentes para o tratamento dos pacientes com este transtorno (WEISER et al., 2012).
A introdução dos primeiros antipsicóticos na década de 50 alterou a evolução natural da esquizofrenia, assim como proporcionou subsídios para uma melhor compreensão de mecanismos envolvidos em sua fisiopatologia. Os antipsicóticos típicos são bem efetivos na redução dos sintomas positivos (alucinações e desilusões) em uma grande proporção de pacientes, entretanto, esses medicamentos têm efeitos mínimos contra sintomas negativos e cognitivos, além de causarem uma série de efeitos colaterais sobre o sistema extrapiramidal como a discinesia tardia (TANDON et al., 2010).
O fato de os antipsicóticos atípicos terem sido elaborados para serem mais eficazes no tratamento de pacientes refratários e na diminuição dos sintomas negativos e cognitivos levou ao otimismo de que melhores tratamentos antipsicóticos para a esquizofrenia fossem possíveis (TANDON et al., 2010). Entretanto, é observado nos pacientes, que os tratamentos atualmente existentes não são suficientes para o controle eficaz dos sintomas negativos e cognitivos. Desta forma, a utilização de modelos que permitam estudar o curso
neurodesenvolvimental do transtorno e novos fármacos com potencial terapêutico e preventivo é de extrema importância.
O desenvolvimento de modelos animais tem sido uma ferramenta importante na investigação intracelular de sistemas que possam estar envolvidos na esquizofrenia. A utilização dos modelos para o estudo da esquizofrenia é um grande desafio, dada a sua complexidade, mas extremamente importantes (CHINDO et al., 2012).
Em linha com esta evidência, o presente estudo se propôs avaliar o desempenho da cetamina em animais neonatos, como indutor de um modelo animal de esquizofrenia e a sua capacidade de atingir os critérios de face, preditivo e constructo, necessário para a validação de modelos animais. É importante salientar que esta droga devido ao seu potencial de bloquear receptores NMDA, ser agonista de receptores dopaminérgicos D2, além de possuir outros mecanismos relacionados, bem como ser de fácil aquisição, visto que é utilizada tanto na clínica médica como veterinária como anestésico, já é usada há alguns anos em animais adultos como modelo de esquizofrenia (BECKER et al., 2003).
Baseado no fato de que um modelo animal de esquizofrenia deve ter características similares a alguns sintomas característicos do transtorno, um dos parâmetros de base a ser avaliado é a Inibição pré-pulso (IPP). Este teste oferece uma medida operacional do filtro sensório-motor refletido pela capacidade de inibição de um reflexo de sobressalto, quando um estímulo sensorial é precedido por outro de menor intensidade (WEISS E FELDON, 2001). A IPP está diminuída ou ausente em pacientes esquizofrênicos sendo considerado um dos mais importantes endofenótipos para este transtorno (MANSBACH; GEYER; BRAFF, 1988). Esses pacientes também apresentam déficit cognitivo que pode aparecer durante o prodromo e persistem durante a evolução do transtorno (TANDON et al., 2008). Para avaliação deste parâmetro (déficit cognitivo), em nosso desenho experimental, foi realizado o teste de Y-maze. Desta forma, observamos que a administração neonatal do antagonista de receptores glutamatéricos NMDA, cetamina, na dose de 5 mg/kg foi capaz de causar alterações na Y-maze na idade adulta dos animais, o que sugere que este modelo, a exemplo de outros como o desafio imune neonatal por Poly I:C (MACEDO et al., 2012), é capaz de simular o curso neurodesenvolvimental da esquizofrenia. Por outro lado, com relação à memória de trabalho, o défict neste comportamento, também após tratamento com
a dose de cetamina 5 mg/kg no período neonatal, ocorreu em animais adolescentes e adultos, sugerindo que o modelo está de acordo com o que se descreve na literatura clínica da esquizofrenia, ou seja, déficit cognitivo no pródromo, que no caso da nossa condição exprimental se avalia na adolescência do animal.
Após uma vasta procura na literatura científica não foram encontrados estudos avaliando os efeitos da administração neonatal de cetamina como modelo neurodesenvolvimental de esquizofrenia, tampouco a separação de animais para a realização de experimentos pré-clínicos nos diversos modelos de esquizofrenia em acordo com o sexo e fase do ciclo estral. Esta questão atualmente é de extrema relevância no estudo deste transtorno mental, visto que os sintomas da esquizofrenia podem ser potencializados de acordo com a fase do ciclo menstrual em mulheres (SEEMAN, 2012), bem como estudos sugerem um efeito terapêutico do estrógeno na esquizofrenia (KULKARMI, 2009). Baseado nesta evidência, em nossos estudos se observou que a administração de cetamina 5mg/kg do sétimo ao décimo primeiro dias de nascimento induz diminuição da IPP nos animais e déficit cognitivo pelo teste Y-maze, em animais adultos, e no caso das fêmeas este efeito aparece predominantemente na fase de diestro, fase do ciclo estral de animais caracterizada pelos níveis mais baixos de estradiol. Para certificar a fase do ciclo que a rata se encontrava no momento do estudo comportamental além da observação do esfregaço vaginal foi realizada análise laboratorial no plasma das ratas, onde