S PESIALPEDAGOGISKE TILTAK OG UNDERSØKELSESLANDSKAP

A exposição de mistura de micotoxinas é um assunto recente na comunidade científica, pelo que ainda poucos são os estudos sobre as interações e consequências para a saúde humana. Ainda mais problemático é a falta de normas harmonizadas para proceder à avaliação de efeitos tóxicos e à avaliação destas exposições208_{, o que}

invalida uma comparação dos mesmos. No entanto foram analisados os diversos estudos sobre estas misturas binárias, quer no âmbito das suas concentrações nos alimentos, quer na sua toxicidade combinada.

5.2.1. Estudos sobre as concentrações das misturas binárias de AF (incluindo AFM1) e OTA e de DON e ZON nos alimentos

Um estudo belga a 174 géneros alimentícios à base de cereais colhidos em supermercados indicou uma média de quatro micotoxinas presentes por cada alimento.209

A nível mundial, um estudo da BIOMIN a 4218 amostras revelou que em 45% delas foi detetada a presença de duas ou mais micotoxinas, portanto, a ocorrência de multimicotoxinas é uma realidade preocupante. As micotoxinas mais prevalentes no mundo são o DON, as fumonisinas e a ZON.210

Num levantamento dos artigos científicos à escala mundial sobre a presença de multimicotoxinas, a coocorrência natural de micotoxinas é maioritariamente devida às AF, à OTA, à ZEA, às fumonisinas e aos tricotecenos (especialmente ao DON). Mundialmente, as combinações mais comuns são de AF com OTA ou de AF com fumonisinas ou ZON. A nível europeu a mistura mais relatada foi de AF + OTA, seguida de outras combinações, nomeadamente de DON + ZON, DON + nivalenol e DON + toxina T2.37

Um estudo polaco reportou que quase 50% (n = 117) das amostras de centeio analisadas apresentavam a combinação de DON + ZON.211 _{Também em trigo chinês}

esta mistura foi a mais detetada.212

Em 2015 foi publicado um estudo para a deteção da coocorrência de AF, DON e ZON em 30 amostras de alimentos de consumo infantil colhidos em Pamplona, Colômbia. Das 30 amostras, apenas em uma se detetaram mais de uma micotoxina.62

Em Portugal, pesquisou-se a presença de diversas micotoxinas no milho para pipocas e pipocas, nomeadamente a procura de DON e ZON. Das 30 amostras, nenhuma continha esta combinação e apenas uma continha ZON (124 µg/Kg).213

Na pesquisa de diversas micotoxinas em 18 amostras de cereais de pequeno- almoço no mercado português, 13 delas continham DON e 12 continham ZON, sendo

40

que 10 amostras continham as duas micotoxinas em simultâneo. A concentração média de DON foi de 194 µg/Kg e a concentração de ZON foi de 42 µg/Kg. Neste estudo 13 amostras de farinhas de milho, trigo e mandioca também foram analisadas, sendo que 6 amostras apresentaram DON e 3 amostras apresentaram ZON – destes resultados positivos, duas continuam a mistura. A concentração média de ZON foi de 253 µg/Kg e de DON foi de 21 µg/Kg.188

Ainda no mercado português, dos 27 alimentos para bebés analisados (farinhas e fórmulas para lactentes), 10 continham AFM1 (concentrações entre 0,017 e 0,041 µg/Kg), 7 continham a AFB1 (0,009 µg/Kg) e 16 continham OTA (concentrações entre 0,034 e 0,212 µg/Kg). Das 22 amostras positivas, 10 continham pelo menos duas micotoxinas em simultâneo.214

Em 21 amostras de amêndoas portuguesas foram pesquisadas AF, sendo que apenas numa foi detetada a presença de B1, a uma concentração de 4,97 µg/Kg.215

Em Portugal, as rações também foram examinadas quanto à presença de algumas micotoxinas. Um levantamento em 2008 de todos os estudos a nível nacional detetou a presença de AFB1 em 27,5% das amostras (n=436, sendo a gama de concentrações entre 1 e 80 µg/Kg), de OTA em 16,4% das amostras (n=220, sendo as concentrações entre 2 e 5 µg/Kg), de DON em 7,5% das amostras (n=361, variando entre 100 e 1649 µg/Kg) e de ZON em 5% das amostras (n=80, variando entre 104 e 356 µg/Kg).216 _Mais

recentemente, em 2011, das 277 amostras de rações para porcos de engorda utilizadas em Portugal, 21 delas continham OTA, 47 continham DON e 69 continham ZON (com concentrações médias de, respetivamente, 3,9 µg/Kg, 223,2 µg/Kg e 18,9 µg/Kg).217

5.2.2. Estudos sobre a toxicidade das misturas binárias de AF (incluindo AFM1) e OTA e de DON e ZON

O conhecimento dos mecanismos individuais de ação pode ajudar a prever os potenciais efeitos interativos das misturas de micotoxinas, todavia cada mistura deve ser experimentalmente analisada, pois a toxicidade combinada é difícil de prever porque se trata de um processo multifatorial, uma vez que diversos fatores como a concentração relativa de cada toxina da mistura e a capacidade metabólica das células podem influenciar o efeito final da combinação.37

Para a deteção destas interações é necessário selecionar o melhor modelo experimental. Atualmente, com a preocupação social sobre os testes em animais, a aposta nos testes em linhas celulares é uma realidade. Para estes testes é recomendada a utilização de várias linhas celulares (devido às diferentes sensibilidades possíveis), sendo que a escolha da linha deve representar um órgão de atuação de

41

ambas as micotoxinas. Este modelo deve ainda ter em consideração as concentrações das micotoxinas a que a população esteja exposta.218,219

Alguns estudos sobre efeitos adversos combinados recorrem à clássica análise isobolográfica.220,221 _{Muito comum na determinação de interações entre fármacos, trata-}

se de um método experimental que define um gráfico no qual cada ponto representa um par de doses de duas substâncias que atingem a dose letal 50 quando administradas em associação. Trata-se de um método que permite identificar os três tipos de interações (adição, sinergismo e antagonismo) e é independente do mecanismo de ação ou da natureza das relações dose-resposta.

No entanto, os métodos de referência mais comuns para a avaliação dos efeitos de misturas são os modelos de concentração-adição (CA) e de ação independente (AI).90

O modelo CA assume que a ação conjunta dos químicos de uma mistura com modo de ação similar é o somatório das toxicidades individuais (equação 1).222–226

X = 𝑝𝐴

𝑥𝐴 + 𝑝𝐵

𝑥𝐵 + … (Equação 1)

Na qual X é a concentração da mistura que provoca um efeito específico, pA é a fração da micotoxina A na mistura (e assim por diante para as restantes micotoxinas) e

xA é a concentração da micotoxina A que provoca esse efeito específico (e assim por diante para as restantes micotoxinas).

O modelo AI baseia-se no princípio de que os efeitos da interação podem ser estimados pelas probabilidades de respostas (equação 2).225,227–229 Foi projetado para misturas de tóxicos que possuem mecanismos de ação distintos em que a probabilidade de toxicidade associada a um dado composto é independente da do outro composto.226

E = 1 – [ (1 – eA)(1 – eB)(…) ] (Equação 2)

Na qual E é o efeito da mistura numa concentração específica e eA é o efeito da

micotoxina A naquela concentração específica (e assim por diante para as restantes

micotoxinas). Para uma gama de concentrações para o efeito em causa são calculados vários pontos E e definida uma curva.

Embora qualquer um destes modelos possa ser suficiente para fins de avaliação de risco, uma vez que a diferença na predição de ambos não é grande, é desejável que seja usado apenas um modelo para todas as situações porque, aliás, os mecanismos de ação são frequentemente desconhecidos.228,229

Um estudo português determinou um decréscimo da viabilidade celular após a exposição por 48 horas de AFM1 e OTA, em linhagem de células do epitélio intestinal

42

humano. Neste estudo, os grupos de células foram expostos a cinco concentrações diferentes de AFM1 (de 0,5 a 10 µM) e, a cada um destes grupos, foi combinada uma gama de concentrações de OTA (de 2,5 a 10 µM). Segundo o modelo CA, o efeito combinado é antagonístico. Já segundo o modelo AI, definiu-se um efeito dependente da dose: um padrão antagonístico em doses mais baixas, embora em doses mais altas se tenha verificado um aumento da toxicidade (sinergismo). Pondera-se que o efeito antagonista derive de uma competição pela glutationa, o que diminuirá as espécies reativas de oxigénio. Dadas as baixas concentrações a que o Homem está exposto, o efeito antagonístico, segundo os autores, é o mais realista, pelo que não se espera que a mistura destas micotoxinas constitua um perigo superior ao do exercido individualmente.226

Expostos através de ração contaminada com AFB1 e OTA, verificou-se um efeito sinérgico na inibição de crescimento e mortalidade de pintos. O principal efeito desta interação não foi a hepatotoxicidade, mas sim a nefrotoxicidade.230

Um estudo em coelhas prenhas avaliou os efeitos teratogénicos provocados pela exposição a alimentos contaminados com a mistura de OTA e AFB1 (0,05 + 0,05 e 0,1 + 0,1 mg/kg) durante 6 a 18 dias.231 _{No geral, os efeitos foram antagonistas, uma}

vez que determinadas anomalias observadas pela exposição individual à OTA estavam ausentes, resultado também obtido em ratos232_{. No entanto, o comprimento cabeça-}

nádega dos fetos expostos à combinação foi menor que o do grupo controlo e verificaram-se novos efeitos adversos. Particularmente na combinação mais elevada verificou-se uma diminuição do peso médio fetal, o aumento de anomalias viscerais e alterações histopatológicas.

Células de rim de bovino foram expostas por 48 horas à mistura de AFB1 (0,1 ng/ mL a 1,28 mg/ mL), OTA (0,5 ng/ ml a 3 mg/mL) e fumonisina B1 (0,25 a 8 mg/ mL). Nas concentrações mais altas foi detetado um aumento da citotoxicade.233

Num estudo234 _{em frangos com 1 a 35 dias, a combinação de AF e OTA levou a um}

menor ganho de peso corporal (efeito aditivo), tal como reportado em outros estudos235–

237_.

Num estudo a leitões expostos à mistura de AF (2 mg/ Kg) e OTA (2 mg/ Kg) por 28 dias, o efeito em conjunto levou a um aumento do peso do fígado e à diminuição de diversos valores séricos (como, por exemplo, o volume corpuscular médio e a concentração de fósforo), definindo-se o efeito aditivo.238

Ainda para esta combinação foram observados efeitos tóxicos aditivos, com um aumento do nível de espécies reativas de oxigénio, em células derivadas de hepatocarcinoma (células HepG2).239 _{O efeito aditivo foi também observado em células}

43

Vero (rim) expostas a esta mistura, nomeadamente na diminuição significativa da viabilidade celular, no aumento da fragmentação do DNA e na ativação da apoptose.240

A avaliação do impacto da exposição ao DON em conjunto com os metabolitos da ZON (α-ZON e β-ZON) em células de granulosa bovina (ovários) foi realizada pela medição da proliferação celular e da esteroidogénese. A exposição combinada a DON e α-ZON indicou que a proliferação celular foi negativamente afetada e que ocorreu uma maior inibição da produção de estradiol (efeito aditivo), enquanto que a produção de progesterona não foi afetada. Já a mistura de DON e β-ZON em concentrações elevadas teve um efeito antagonista em relação à produção de progesterona.241

Vinte leitões estiveram expostos durante 28 dias a uma de duas situações: DON (2 mg/ Kg) + nivalenol (1,3 mg/ Kg) + ZON (1,5 mg/ Kg) ou DON (3 mg/ Kg) + nivalenol (1,3 mg/ Kg) + ZON (1,5 mg/ Kg). Verificou-se, por comparação com os efeitos adversos decorrentes da administração simples de cada micotoxina, uma diminuição no ganho de peso, um aumento nas alterações histológicas (intestinos, fígado e órgãos linfoides) e um aumento na taxa de apoptose dos linfócitos nos gânglios linfáticos e no baço.242

A função imune foi avaliada através da resistência à Listeria monocytogenes em ratos expostos à mistura de DON e ZON por 23 semanas. Verificou-se que, face à resistência individual do DON, a resistência a esta bactéria foi reduzida na presença da mistura, embora a capacidade do DON para inibir a resposta de hipersensibilidade retardada tenha sido significativamente diminuída na presença da ZON. A imunossupressão pode resultar das interações entre os efeitos imunotóxicos do DON e da ZEA e os efeitos nutricionais associados à recusa alimentar resultante do DON.243

A multiexposição a alternariol, DON e ZON por células de leucemia mieloblástica aguda pretendeu examinar resposta imune através da taxa de diferenciação dos monócitos em macrófagos. A exposição combinada contribuiu para uma maior inibição desta diferenciação (efeito aditivo).244

Diversos estudos foram elaborados no sentido de perceber o efeito da interação do DON com a ZON. Células de adenocarcinoma do epitélio colorretal humano foram expostas por 72 horas a misturas de DON (com concentrações de 10 a 20 µM) e ZON (10 a 20 µM) e o efeito aditivo foi observado.245 _{O mesmo efeito se verificou na exposição}

por 14 dias a células progenitoras hematopoiéticas quando sujeitas a concentrações de 0,04 a 0,1 µM de DON e 0,2 a 10 µM de ZON.36

Em células do carcinoma humano do cólon expostas por 24 horas à mistura de DON (100 µM) e ZON (40 µM) foram analisadas a viabilidade celular, o ciclo celular, o potencial de membrana mitocondrial e a abertura do poro de transição de permeabilidade. Individualmente, todos estes fatores foram afetados negativamente,

44

todavia, quando combinadas, as micotoxinas reduziram a toxicidade observada individualmente

.

Num estudo à viabilidade de células epiteliais do jejuno de suínos, a exposição por 2 dias às misturas de DON (0,5 a 2 µM) e ZON (10 a 40 µM) originaram, em concentrações baixas, efeitos antagonísticos e, em concentrações altas, efeitos sinérgicos.247,248

Em células de hepatoma humano, a exposição combinada de DON (concentrações de 0,1 a 5 μg/mL) e ZON (0,1 a 10 μg/mL) por 24 horas levou a uma diminuição acentuada da viabilidade celular (efeito aditivo).249

A capacidade antioxidante total hepática foi aumentada e a concentração de malondialdeído (marcador de stress oxidativo) foi diminuída pela exposição à mistura de DON e ZON, o que indica efeitos antagonísticos. Todavia, verificaram-se efeitos sinergéticos no que concerne à expressão do ARNm, o que teoricamente não seria de esperar face aos efeitos antagónicos detetados.250

A mistura binária DON e ZON (10 + 10 µM) levou a uma menor inibição da síntese de ADN (efeito antagonístico), todavia levou a um aumento da indução da fragmentação de ADN. A mistura tripla a DON, ZON e fumonisinas B1 produziu efeitos sinérgicos na peroxidação lipídica de células de adenocarcinoma de cólon humano.245