Devido à sua estrutura química, marcadores de spin de natureza lipídica, quando intercalados em bicamadas, assim como os fosfolipídios não marcados, possuem a tendência de se orientar com seus eixos longos moleculares aproximadamente paralelos à normal à bicamada (Figura 3.14). Quando se trabalha com lipossomas, vesículas, e mesmo algumas micelas suficientemente grandes, o tempo de rotação dessas estruturas é suficientemente alto, de modo que elas podem ser consideradas paradas na escala de tempo do RPE. Assim, o que se observa é uma soma dos espectros das moléculas incorporadas no agregado. Como essas moléculas estão orientadas em um meio anisotrópico, o que se observa é um espectro composto pela soma de todos os espectros com todas as orientações em relação ao campo magnético. Além disso, em membranas suficientemente fluidas, as moléculas podem apresentar vários tipos de movimentos: rotação ao redor do eixo longo molecular, difusão lateral, e, quando se trata de moléculas com movimentos intra-moleculares, como ocorre com compostos que possuem cadeias acila, esses movimentos (que ocorrem em diferentes escalas de tempo) podem contribuir para a forma das linhas espectrais. Também neste caso, o espectro observado corresponde à soma de todos os espectros correspondentes às várias orientações do marcador em relação ao campo magnético aplicado. Como em todas as situações descritas as moléculas encontram-se em um ambiente anisotrópico, esses espectros são chamados de espectro de pseudo-pó (Schreier, 1979).
Figura 3.14 – Estrutura química do marcador de spin 16PCSL em configuração estendida (todas as ligações das cadeias acilas em trans) com os eixos arbitrários do grupamento nitróxido atribuído.
Marcadores de spin do tipo nPCSL possuem o eixo z do nitróxido aproximadamente paralelo ao eixo longo molecular (Figura 3.14). Assim, espera- se que no caso de movimento rápido ao redor do eixo longo molecular, e quando o grupamento doxil está ligado aos carbonos mais próximos da cabeça polar, que provê um forte ancoramento à interface membrana-água, o espectro deve apresentar extremos externos e extremos internos (medidos por 2A|| e 2A┴,
respectivamente, como mostrado na Figura 3.15) que representam os valores de desdobramento hiperfino para moléculas com o eixo longo molecular aproximadamente paralelo e perpendicular ao campo magnético, respectivamente. A existência dessas características espectrais informa que o eixo longo molecular (z) executa rotação rápida na escala de tempo do experimento, o que tem como consequência gerar no plano xy a média dos valores de Axx e Ayy. Nesse caso é
possível calcular um parâmetro de ordem (S, chamado Sef) a partir dos valores de
2A|| e 2A┴ medidos no espectro através da equação 3.17 (Schreier et al., 1978). O
parâmetro de ordem é interpretado como refletindo a amplitude de movimento do eixo longo molecular. Quanto maior S, menor a amplitude e mais ordenados os lipídios formadores da membrana.
2A|| 2A 10 G W0 A h +1 10 G B h0 W0
Figura 3.15 – Ilustração das medidas dos parâmetros utilizados para a análise dos espectros de RPE. (A) Medidas de extremos externos (2A||) e internos (2A┴) e largura da linha de campo central (W0) do marcador 5PCSL intercalado em LUV de 10CL na ausência de peptídeo. (B) Medidas das alturas das linhas de campo baixo (h+1) e central (h0) e largura da linha de campo central (W0) do marcador 16PCSL intercalado em LUV de 10CL na ausência de peptídeo.
= ||− ⊥
−� + �2 (Equação 3.17)
onde Axx, Ayy, e Azz representam os valores principais do tensor hiperfino (Axx = 5,9
G, Ayy = 5,4 G e Azz = 32,9 G para o doxilpropano, Jost et al., 1971) e A|| e A┴ são,
respectivamente, os valores de extremos externos e extremos internos medidos no espectro (Figura 3.15).
Quando a molécula possui movimentos intra-moleculares, esses também contribuirão para o valor se S. Hubbell e McConnell (1971), empregando tratamento de mecânica estatística apresentaram uma equação para analisar S em termos das contribuições da orientação do eixo longo molecular (S0) e de
isomerizações trans-gauche em consequência da rotação ao redor de ligações simples -C-C- (Pt e Pg, onde os termos correspondem à probabilidade de
rotâmeros trans e gauche, respectivamente, e Pt + Pg = 1). Contudo, nós não
fizemos essa análise e os valores de S apresentados (Sef) foram calculados a
partir das medidas de 2A|| e 2A┴ nos espectros. A literatura tem mostrado que em
membranas fluidas ocorre um gradiente de flexibilidade, com a mobilidade aumentando ao longo da cadeia acila devido ao crescente distanciamento desses carbonos da região de ancoramento – a cabeça polar (Hubbell e McConnell, 1971, Jost et al., 1971). Em consequência, o espectro perde a resolução de extremos externos e internos e adquire a forma de três linhas estreitas à medida que o grupamento nitróxido se aproxima da metila terminal da cadeia. Essa forma espectral não permite a medida de extremos externos e internos, porém sabe-se que, devido às características geométricas das moléculas e do ambiente onde se encontram, os espectros ainda são determinados tanto por propriedades de orientação como de mobilidade. Essas informações poderiam ser obtidas a partir de simulações espectrais com programas como os do grupo de Freed (Schneider e Freed, 1989; Budil et al., 1996). Porém, esses programas não foram empregados no presente trabalho. Levando em conta as considerações acima, os espectros foram analisados através do parâmetro empírico h0/h+1, relação das alturas dos
picos de campo central e campo alto. Segundo Schreier e colaboradores (1984), estão embutidas nesse parâmetro as contribuições tanto de ordem como de mobilidade para as formas espectrais. Quanto menor h0/h+1, maior a mobilidade
A discussão acima é válida para o caso em que a molécula executa um movimento rápido ao redor do eixo longo molecular na escala de tempo do experimento. No entanto, quando esse movimento é lento, como é o caso de membranas em fase gel, por exemplo, o formalismo para o cálculo de S não pode ser empregado. Nesse caso, marcadores contendo o grupamento nitróxido próximo da cabeça polar costumam fornecer espectros indicativos de alta imobilização, com grandes separações entre extremos externos e internos (ver espectro de 5PCSL em presença de TRP3 na Figura 4.44 (espectro D). É também usual a perda do pico de campo alto utilizado para a medida de 2A┴. Assim,
frequentemente esses espectros são analisados através da medidados extremos externos, denominada 2Amax. Amax equivale a A|| para os casos em que o
movimento ao redor do eixo longo molecular é rápido e podem ser feitas comparações entre ambos em casos em que não se pode medir A┴ em um dos
espectros.
Nos casos em que o espectro experimental corresponde à somatória de vários espectros, a largura da linha de campo central (W0, Figura 3.15) refletirá a
somatória das larguras de todos os espectros contribuintes, bem como sua posição no campo magnético devido à influência de diferentes valores de g para os espectros. Quando os marcadores estão intercalados em membranas, devido ao gradiente de flexibilidade ao longo da cadeia acila, a linha de campo central resultante terá a contribuição de espectros mais alargados devido ao movimento mais restrito quando o marcador se encontra mais próximo à região da cabeça polar. À medida que o marcador se aproxima da metila terminal, seu movimento será mais rápido e, consequentemente, as linhas mais estreitas. Assim, deve-se esperar uma diminuição (gradiente) de W0 à medida que o espectro monitora
regiões mais profundas na membrana.
3.2.4.3.G – Estudos do efeito da ligação dos peptídeos sobre a