4. Empiri
4.2 Sårbarhet i vannforsyningen
4.2.1 Sårbarhet i myndighetsutøvelse/tilsynsfunksjon
3.1 Estimador Kaplan-Meier por famílias
Através do estimador de Kaplan-Meier, podemos obter os valores de falhas (mortes), censuras (sobrevivência), a porcentagem de animais censurados, o valor médio de mortalidade em dias e a mediana dos desafios virais 1; 2; 3 e do conjunto de dados dos três
28
desafios virais (Tabela 1), considerando que cada experimento durou o tempo de vinte dias (t=20).
O desafio viral 2 apresentou um número menor de animais no total (803), se comparado aos desafios 1 e 3, devido à perda de um tanque durante o experimento. A média de sobrevivência, em dias, ficou entre 8,9 e 9,8 dias nos três desafios virais analisados e houve uma diminuição da porcentagem de censura, ou seja, uma diminuição da sobrevivência dos camarões L.vannamei a cada desafio viral.
Tabela 1 Total de camarões por desafio, valores de falha, censura, porcentagem de censura, média, erro padrão e valor estimado da mediana para os desafios virais 1; 2; 3 e para o conjunto de dados (4)
Desafio Total Falhas Censura Cesura(%) média erro padrão Mediana
1 1234 975 259 20,99 9,7536 0,1332 7
2 803 716 87 10,83 8,9598 0,145 7
3 1221 1161 60 4,91 8,9345 0,0958 8
4 3258 2853 405 12,43 9,3293 0,0748 8
A aplicação do estimador produto limite também permite comparar o conjunto de curvas de sobrevidas das diversas características quanto a uma única covariável por vez, e, para esta comparação, recomenda-se utilizar o teste de Log-Rank (COX & OAKES, 1984). Com a estatística de Log-Rank, podemos testar a hipótese de que as curvas de sobrevivências são iguais para os estratos testados.
Considerando o teste de Log-Rank, ao nível de 0,0001 de probabilidade, constatou-se diferença significativa entre as 60 famílias analisadas nos desafios virais 1 e 2 e na análise conjunta dos dados que englobou as 180 famílias (Tabela 2). Foram feitos, neste sentido, os ajustamentos por comparações múltiplas usando o método de Tukey-Kramer, ao nível de 5% de probabilidade, que revelaram diferenças significativas entre algumas famílias desses desafios como apresentado na Tabela 3, onde foram contrastadas as famílias com os maiores e menores percentuais de censura em cada desafio viral. Entre as famílias do desafio viral 3, não houve diferenças significativas pelo teste de Log-Rank ao nível de significância de p<0,001 e, consequentemente, nem pelo método Tukey-Kramer; a falta de diferenças significativas entre as famílias do desafio 3 se deve provavelmente à grande mortalidade observada neste desafio viral (mortalidade acima de 95%), havendo desta maneira uma menor diferença de sobrevivência entre as famílias.
29 Tabela 2 Teste de Log-Rank para as curvas de sobrevivência das famílias testadas nos desafios virais 1, 2, 3 e Conjunto de dados Teste de Log-Rank χ2 G L Pr >χ2 Desafio 1 161,2084 59 <,0001 Desafio 2 117,2166 59 <,0001 Desafio 3 88,3435 59 0,008 Conjunto 435,3278 179 <,0001
χ2= Valor da estatística qui-quadrado; GL= graus de liberdade.
Apesar de essas famílias terem sido compostas por irmãos completos, elas não foram anteriormente selecionadas para a característica de resistência e tolerância ao IMNV, pois através do desenvolvimento de métodos experimentais obtem-se ferramentas necessárias para iniciar uma seleção para resistência a doenças. Os animais utilizados nos desafios virais já vinham sendo selecionados para outras características, como ganho de peso. Segundo Moss et al. (2005), em uma pesquisa com irmãos completos de L. vannamei contaminados com o vírus da Taura e da Mancha Branca, foi observada uma correlação fenotípica negativa significativa entre a sobrevivência média da família e o seu peso médio de colheita em uma lagoa de engorda. Além do crescimento, a resistência a doenças em camarões pode ser negativamente correlacionada com outras características comercialmente importantes, como a qualidade da carcaça ou fecundidade, embora esses dados sejam escassos. A relação negativa entre a resistência a doenças e o crescimento não é uma premissa universal, mas varia de acordo com o patógeno e o hospedeiro.
No desafio viral 1, as famílias que apresentaram os maiores percentuais de censura foram as de número 26, 37 e 44; e as famílias que apresentaram os menores percentuais de censura foram as famílias 17; 38; 41; 48 e 65. Os valores de falhas e indivíduos censurados por família podem ser encontrados no Anexo 1. No desafio 2, houve diferença significativa entre as famílias 6 e 36. Os valores de falhas e indivíduos censurados, por família, deste desafio podem ser encontrados no Anexo 2.
30 Tabela 3 Ajuste de comparações múltiplas, utilizando o método de Tukey-Kramer, ao nível de 5% de probabilidade, entre famílias para o teste de Log Rank
χ2= Valor da estatística qui-quadrado; GL= graus de liberdade
Para a análise conjunta dos dados, houve diferenças significantes entre as famílias 20; 31; 34 e 38, que apresentaram os maiores percentuais de censura, e as famílias 11; 32; 35; 42;
P- valor
Família Família χ2 Significância Tukey Kramer
17 26 20,0759 <.0001 0,0100 17 37 17,9900 <.0001 0,0268 26 38 21,5055 <.0001 0,0050 26 41 23,7044 <.0001 0,0017 26 48 17,3069 <.0001 0,0366 26 65 17,0787 <.0001 0,0406 37 38 19,3157 <.0001 0,0144 37 41 21,4004 <.0001 0,0053 41 44 16,9839 <.0001 0,0424 Desafio 2 6 36 16,8217 <.0001 0,0456 11 20 27,9040 <.0001 0,0017 11 31 25,3530 <.0001 0,0059 20 32 30,7101 <.0001 0,0004 20 35 31,9503 <.0001 0,0002 20 42 24,5554 <.0001 0,0086 20 45 21,1414 <.0001 0,0413 20 54 21,6107 <.0001 0,0335 20 58 23,4734 <.0001 0,0143 20 66 28,4249 <.0001 0,0013 20 69 22,2122 <.0001 0,0256 20 92 25,3131 <.0001 0,0060 20 97 24,9467 <.0001 0,0072 20 101 24,2402 <.0001 0,0100 20 102 26,7437 <.0001 0,0030 20 114 21,7731 <.0001 0,0312 20 135 20,9064 <.0001 0,0458 20 149 21,7412 <.0001 0,0316 20 179 22,2484 <.0001 0,0251 31 32 28,0182 <.0001 0,0016 31 35 29,2183 <.0001 0,0009 31 42 22,1495 <.0001 0,0263 31 58 21,1246 <.0001 0,0416 31 66 25,7095 <.0001 0,0050 31 92 22,7282 <.0001 0,0202 31 97 22,4021 <.0001 0,0234 31 101 21,6734 <.0001 0,0326 31 102 24,1095 <.0001 0,0106 32 38 21,9774 <.0001 0,0284 34 35 21,4785 <.0001 0,0355 35 38 23,0888 <.0001 0,0171 Dados conjuntos Log rank Desafio 1
31
45; 54; 58; 66; 69; 92; 97; 101; 102; 114; 135; 149 e 179, que apresentaram o menor percentual de censura nos três desafios virais. Podemos observar que as famílias com a maior porcentagem de sobreviventes (maior número de censura), na análise dos dados conjuntos dos desafios virais, foram as famílias provenientes do desafio 1. Apesar de não terem sido detectadas diferenças entre as famílias do desafio viral 3, seus valores e percentuais de censura podem ser encontrados no Anexo 3.
Os gráficos que representam as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier podem estimar diretamente o percentual de evento ao final de qualquer intervalo de tempo. Assim foram obtidas, na Figura 3, as curvas da probabilidade de sobrevivência com um limite de confiança de 95% pela estimativa da sobrevivência por Kaplan-Meier em cada desafio viral.
A curva de sobrevivência do desafio viral 1 (Figura 3A) apresentou um declínio na sobrevivência de 5 a 18 dias, correspondendo a redução na probabilidade de sobrevivência ao evento de 1 para 0,2099 (100% para 20,99%). Neste período, obteve-se um percentual de falha de 79,10%. Após o 18° dia, a curva de sobrevivência assumiu uma linha reta paralela ao eixo do tempo com o valor fixo de probabilidade de sobrevivência ou censura de 20,99%.
Figura 3A. Representação gráfica da probabilidade de sobrevivência de camarões L. vannamei, no tempo de 20 dias, com limite de confiança de 95% para o desafio 1.
O desafio 2 (Figura 3B) apresentou um declínio de 4 a 19 dias, correspondendo a redução na probabilidade de sobrevivência ao evento de 1 para 0,1083. Neste período, obteve- se percentual de falha ou mortalidade de 89,17%, sendo que, após o 19° dia, a curva de sobrevivência assumiu uma linha reta paralela ao eixo do tempo, com o valor fixo de probabilidade de 10,83%.
32 Figura 3B. Representação gráfica da probabilidade de sobrevivência de camarões L. vannamei, no tempo de 20 dias, com limite de confiança de 95% para o desafio 2.
O desafio 3 (Figura 3C) apresentou um declínio de 2 a 19 dias, correspondendo a redução na probabilidade de sobrevivência ao evento de 1 para 0,0491. Neste período, obteve- se percentual de falha ou mortalidade de 95,09%, sendo que, após o 19° dia, a curva de sobrevivência assumiu uma linha reta paralela ao eixo do tempo, com o valor fixo de probabilidade de sobrevivência de 4,91%.
Figura 3C Representação gráfica da probabilidade de sobrevivência de camarões L. vannamei, no tempo de 20 dias, com limite de confiança de 95% para o desafio 3.
A Figura 3D representa a análise do conjunto dos dados (desafios 1, 2 e 3), apresentando um declínio na sobrevivência de 2 a 19 dias, correspondendo a redução na
33
probabilidade de sobrevivência ao evento de 1 para 0,1243. Neste período, obteve-se um percentual de falha de 87,57%. Após o 19° dia, a curva de sobrevivência assumiu um comportamento retilíneo paralelo ao eixo do tempo, com o valor fixo de probabilidade de sobrevivência de 12,43%. Pode ser observado na Figura 3, um maior declínio na curva de sobrevivência entre o sexto dia e o nono dia, para as três análises. Ao final do nono dia, foi apresentado um percentual de falha de 70,99% para o desafio 1 (Figura 3A); 80,29% para o desafio 2 (Figura 3B), 77,97% para o desafio 3 (Figura 3C) e 75,91% para o conjunto de dados (Figura 3D).
Figura 3D Representação gráfica da probabilidade de sobrevivência de camarões L. vannamei, no tempo de 20 dias, com limite de confiança de 95% para os dados conjuntos (D).
A função de risco, que também é chamada de taxa de falha, representa a taxa instantânea de morte de um indivíduo em um instante “t” (BASTOS & ROCHA, 2006). A função de risco do desafio viral 1 (Figura 4A) apresentou-se crescente até o dia 4, com 1.234 animais sobre risco de morte, tempo em que atingiu o valor de risco máximo perto de 0,087. O risco para o desafio viral 2 (Figura 4B) apresentou-se crescente até o dia 5,5 com 784 animais sob risco, tempo em que atingiu o valor máximo perto de 0,15. O risco para o desafio viral 3 (Figura 4C) apresentou-se crescente até o dia 7, com 1.103 animais sob risco de morte, tempo em que atingiu o valor máximo perto de 0,118. Na análise do conjunto de dados (Figura 4D), temos a curva crescente até 5,5 dias com 3.203 animais sob risco, com o valor máximo da função de risco estimada em 0,098. Na Figura 4, podemos constatar que as curvas
34
dos gráficos são crescentes no período de 0 a 7 dias pós-infecção e logo após, declinam, diminuindo a taxa de risco à infecção após esse período.
35 Figura 4 Função de risco para a ocorrência de sobrevivência à infecção viral em camarões L. vannamei para o desafio 1 (A) , desafio 2 (B) e desafio 3 (C) e para o conjunto de dados (D).
3.2 Estimador de Kaplan-Meier por Tanque
Pelas estimativas de probabilidade de sobrevivência de Kaplan-Meier, foram analisados os dados de sobrevivência (censura) e falha (morte) entre os tanques dentro de cada desafio viral e entre os tanques no conjunto de todos os desafios, a fim de detectar diferenças significativas entre eles. Foram analisados três tanques no desafio 1, dois tanques no desafio 2, três tanques no desafio 3. Para a análise do conjunto de dados os tanques dos desafios virais 1; 2 e 3 foram renumerados de 1 a 8 consecutivamente. A Tabela 4 apresenta o total de falhas e censuras e a porcentagem de censura, por tanque, em cada desafio viral.
36
As análises estratificadas para a variável tanque, pelo método Tukey - Kramer (Tabela 5), apresentaram um resultado significativo (<0,0001) na análise dos dados do desafio 3 e do conjunto de dados entre os tanques, o que pode ser explicado pelas diferenças de percentual de censura entre os tanques em cada desafio viral.
Tabela 4 Total de falhas e censuras dos tanques contendo camarões L. vannamei
Tanque Total Falha Censura Censura(%)
Desafio 1 1 409 327 82 20,05 2 413 319 94 22,76 3 412 329 83 20,15 Total 1234 975 259 20,99 Desfio 2 1 403 363 40 9,93 2 400 353 47 11,75 Total 803 716 87 10,83 Desafio 3 1 410 400 10 2,44 2 408 388 20 4,9 3 403 373 30 7,44 Total 1221 1161 60 4,91
Tabela 5 Ajuste de comparações múltiplas, utilizando o método de Tukey - Kramer, entre os tanques pelo teste de Log Rank
p-valor
Tanque Tanque χ2 Tukey-Kramer
Desafio 3 1 3 36,42 <0,0001 2 3 37,27 <0,0001 Conjunto de dados 2 4 23,11 <0,0001 3 4 27,87 <0,0001 3 7 23,63 <0,0001 4 8 26,34 <0,0001 7 8 22,24 <0,0001
χ2= Valor da estatística qui-quadrado
Foram obtidas as curvas da probabilidade de sobrevivência de camarões L. vannamei no tempo de vinte dias por tanque em cada desafio viral. A curva do desafio viral 1, (Figura 5A), apresentou um declínio na sobrevivência de 1 a 18 dias para o tanque 1; 4 a 18 dias para o tanque 2; e 5 a 18 dias para o tanque 3, correspondendo a uma redução na probabilidade de sobrevivência ao evento de 1 para 0,2005 (100% para 20,05%) no tanque 1, para 0,2276 no tanque 2 e para 0,2015 no tanque 3; os valores do percentual de falha foram respectivamente 79,5%; 77,24% e 79,85%. A curva do desafio 2 (Figura 5B) apresentou um declínio na
37
sobrevivência de 4 a 17 dias para o tanque 1, e de 5 a 19 dias para o tanque 2, correspondendo a uma redução na probabilidade de sobrevivência de 1 para 0,0971 no tanque 1 e 0,1175 no tanque 2, com um percentual de falha de 90,29% e de 88,25%, consecutivamente. Os desafios virais 1 e 2 não apresentaram diferença significativa ao nível de 0,0001 de probabilidade, entre os estratos comparados (tanques) pelo teste de Log-Rank, apresentando valores de p=0,4115 e p=0,007 respectivamente. A curva do desafio viral 3 (Figura 5C), apresentou um declínio na sobrevivência de 2 a 19 dias para o tanque 1; de 4 a 18 dias para o tanque 2; e de 3 a 17 dias para o tanque 3 correspondendo a redução na probabilidade de sobrevivência ao evento de 1 para 0,0244 no tanque 1; 0,0490 no tanque 2; e 0,1266 no tanque 3, sendo que os valores do percentual de falha foram respectivamente 97,56%; 95,10% e 87,34%. A análise dos dados em conjunto dos três desafios virais (Figura 5D) apresentou um declínio nos valores de sobrevivência e valores de porcentagem de falhas já descrito acima para os tanques dos desafios 1; 2 e 3.
39 Figura 5 Representação gráfica da probabilidade de sobrevivência de camarões L. vannamei, no tempo de 20 dias, para o desafio 1 (A), desafio 2 (B), desafio 3 (C) e para o conjunto de dados dos desafios (D), considerando o nível de significância de 0,0001.
3.3 Estimador de Kaplan-Meier por desafio viral
As análises estratificadas para a covariável desafio, pelo método Tukey-Kramer (Tabela 6), apresentaram resultado com diferença significativa (<0,0001) para a análise entre os desafios virais 1 e 2 e 1 e 3. Não houve diferença significativa entre os desafios 2 e 3. O resultado pode ser explicado pela diferença no percentual de censura entre os desafios virais (20,99%; 10,71% e 4,91% para os desafios 1, 2 e 3, respectivamente), indicando um número maior de animais tolerantes à infecção por IMNV no desafio 1.
Tabela 6 Comparações múltiplas entre os três desafios virais para o teste de Log-Rank utilizando o método de Tukey-Kramer
Estrato p-valor
Desafio desafio χ2 Tukey-Kramer
1 2 29,4433 <0,0001
1 3 17,6627 <0,0001
40
Na Figura 6, pode-se observar que o desafio viral 1 apresentou um declínio na sobrevivência de 4 a 18 dias com redução na probabilidade de sobrevivência ao evento de 100% para 20,99% e percentual de falha de 79,01%. Os desafios virais 2 e 3 apresentaram um declínio de 4 a 19 dias; e 2 a 19 dias, com percentual de censura para o desafio 2 de 10,83% e 4,91% no desafio 3. O percentual de falha dos desafios virais 2 e 3 foi respectivamente 89,17% e 95,09%. Essa diferença significativa entre os desafios pode ser explicada pela diferença de animais resistentes (sobreviventes) à infecção pelo IMNV em cada desafio viral, sendo que o desafio viral 1 apresentou o maior percentual de sobreviventes e o desafio 3 apresentou o menor percentual.
41 4. CONCLUSÃO
Por meio do estimador não paramétrico de Kaplan-Meier, foi possível analisar os estratos família e tanque em cada desafio viral, e identificar diferenças significativas entre seus níveis, quanto à característica de resistência ao vírus IMN em camarões L. vannamei.,
Pelo programa de melhoramento genético da empresa, estas famílias não foram anteriormente selecionadas para a característica de resistência e tolerância ao IMNV, sendo estes desafios virais de grande contribuição para posteriores análises genéticas para resistência ao IMNV.
Foi constatado um excessivo número de empates entre as observações de cada desafio, ou seja, um excessivo número de indivíduos que morreram (falharam) no mesmo dia (escala de tempo adotada), caracterizando os dados como grupados, o que não comprometeu sua análise por Kaplan-Meier.
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45 CAPÍTULO 2
Análise de sobrevivência de camarões marinhos Litopenaeus vannamei infectados pelo vírus da mionecrose infecciosa (IMNV), utilizando um modelo de fragilidade para
dados grupados
RESUMO
A espécie Litopenaeus vannamei, nativa da costa do Pacífico, foi introduzida no Brasil, no final dos anos 80. Após 2002, houve a entrada do vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) na região Nordeste do país. Na carcinicultura, programas de melhoramento genético são utilizados para seleção de características como a resistência a vírus. Este estudo teve como objetivo avaliar o tempo de sobrevivência à doença mionecrose infecciosa em camarões marinhos L. vannamei infectados por IMNV, utilizando um modelo de fragilidade para dados grupados. Foram realizados três testes de desafio viral em ambiente fechado com parâmetros de temperatura, pH, oxigênio e amônia da água controlados diariamente. Foram avaliadas 60 famílias de irmãos completos de L. vannamei em cada desafio viral cuja duração foi de 20 dias seguidos. A confirmação da infecção pelo vírus da mionecrose infecciosa nos animais foi feita por meio da técnica de PCR em tempo real utilizando o corante Sybr Green. Foram estimados, em cada desafio, parâmetros genéticos como o valor genético de família e sua respectiva taxa de risco (fragilidade), e a herdabilidade na escala logarítmica por meio do modelo de fragilidade proposto. A herdabilidade estimada foi de 0,59; 0,36; e 0,59 nos desafios virais 1; 2; e 3, respectivamente. Foi possível identificar as famílias que possuem as menores e maiores taxas de risco para a doença, ou seja, a menor e maior suscetibilidade para a morte pós infecção. Esses resultados podem ser utilizados para inclusão da característica de resistência a doença causada pelo vírus da mionecrose infecciosa em programas de melhoramento genético de L. vannamei.
Palavras-chave: dados grupados, mionecrose infecciosa, melhoramento genético, modelo de fragilidade
46 CHAPTER 2
Survival analysis of marine shrimps Litopenaeus vannamei infected by the infectious myonecrosis virus (IMNV) virus, using a frailty model for grouped data
ABSTRACT
The specie Litopenaeus vannamei, native from the Pacific coast, was introduced in Brazil in the late of 80’s. After 2002, the infectious myonecrosis virus (IMNV) entered in the Northeast region. In shrimp farming, breeding programs are used for selecting traits as resistance to viruses.This study was conducted to evaluate the survival time to the myonecrosis infectious disease in marine shrimps L. vannamei infected by IMNV using a model of frailty for grouped data.Three viral challenge tests were performed in a closed environment with conditions of temperature, pH, oxygen and ammonia of the water checked daily. We evaluated 60 full-sib families of L. vannamei in each viral challenge test whose duration was of 20 days. The confirmation of the infection by the virus of the IMN in the animals was done through the technique of PCR in real time using the Sybr Green dye. It was estimated, in each challenge, genetic parameters such as genetic value of family and their respective hazard rate (frailty), and heritability in logarithmic scale through the proposed frailty model. The estimated heritability was 0.59, 0.36, and 0.59 in the viral challenges 1, 2, and 3, respectively. Families that have the lowest and highest hazard rate for the disease were identified, i.e, those families that presented the lower and higher susceptibility to the death after infection. These results can be used to include the characteristic resistance to disease caused by infectious myonecrosis virus in the genetic improvement programs of L. vannamei.
47 1. INTRODUÇÃO
A criação de camarões Litopenaeus vannamei ganhou um importante papel no