As infeções mais comuns causadas por Staphylococcus aureus são cutâneas, no entanto também pode ser responsável por infeções severas (septicémias, endocardites, meningites, pneumonias, osteomielites) em meio hospitalar.
Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Staphylococcus spp., 18-24h de incubação.
Objetivo: Diferenciar Staphylococcus aureus de outras espécies de Staphylococcus spp. Princípio: Capacidade do S. aureus produzir uma coagulase extracelular livre, que atua sobre a protrombina presente no plasma de coelho, dando origem a um produto semelhante à trombina, que irá atuar no fibrinogénio originando um coágulo de fibrina [138].
Procedimento: Num tubo contendo cerca de 0,5mL de plasma de coelho citratado inocular uma colónia isolada e incubar a 35 ± 2ºC, com leitura após 4h de incubação, se ainda não se tiver formado o coágulo prolongar a incubação até às 24h, para descartar possíveis falsos negativos. Pode ocorrer lise do coágulo antes da sua observação por produção de enzimas fibrinolíticas pela estirpe em estudo (falsos negativos) [138].
9.5. Teste de Identificação da Escherichia coli O157:H7
Teste Comercial: E. coli O157 Latex Test, da Oxoid.
A Escherichia coli é parte integrante da microbiota do trato intestinal em humanos saudáveis, contudo, algumas são patogénicas podendo levar a alterações gastrointestinais. O serotipo O157:H7 da E. coli tem sido o mais frequentemente isolado nos casos de colite hemorrágicas e síndrome urémica hemolítica, com produção de uma Verotoxina, sendo esta E.
coli designada de entero-hemorrágica [139].
A transmissão ocorre através da ingestão de água ou alimentos contaminados, ou pelo contacto com animais ou pessoas infetadas (transmissão fecal-oral) estando muito associadas a surtos alimentares [139].
Amostra: Fezes depois de semeadas em meio MCK. As colónias de interesse são as sugestivas de E. coli, não fermentadoras de sorbitol. É necessário testar pelo menos 10 colónias.
Objetivo: Identificação do serogrupo E. coli O157. Método: Reação de aglutinação [140].
O reagente teste contém partículas de latex sensibilizadas com anticorpos específicos reativos contra o antigénio somático O157. O controlo contém partículas de latex sensibilizadas com imunoglobulina de coelho pré-imunizada [140].
Procedimento: Realizar uma suspensão, com 1 gota de solução salina e parte de 1 colónia. Posteriormente, adicionar 1 gota de reagente teste e misturar de forma a cobrir a área de reação. Empreender movimentos circulares ao cartão, 1 minuto, procurando visualizar sinais de aglutinação. Se aglutinar, testar a outra porção da colónia com o controlo para garantir que o isolado não é uma estirpe auto-aglutinante [140].
Sensibilidade: 100%; Especificidade: 99%
9.6. Teste para identificação de Streptococcus pneumoniae
Teste Comercial: Oxoid Dryspot™ Pneumo Test
O Streptococcus pneumoniae é o principal agente causador da pneumonia bacteriana, meningite, otite e bacteriémia. Os sintomas são diversos dependendo da parte do corpo infetada e em casos mais graves pode levar à perda de audição, lesões cerebrais irreversíveis e morte
[141].
Os grupos de risco são os adultos com 65 anos ou mais, crianças menos de 2 anos de idade e indivíduos imunodeprimidos [141].
A virulência deste microrganismo deve-se às propriedades anti-fagocitárias do polissacárido capsular [142].
Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Streptococcus spp. produtores de α- hemólise, com 18-24h de incubação.
Objetivo: Pesquisa do antigénio capsular do Streptococcus pneumoniae, para o diferenciar de outros estreptococos α-hemolíticos.
Método: Reação de aglutinação [142].
O teste utiliza partículas de látex desidratadas em cartão, sensibilizadas com anticorpos específicos para o pneumococo, na área de teste e partículas de látex desidratadas, sensibilizadas com imunoglobulinas não reativas, na área de controlo [142].
Procedimento: Adicionar 1 gota de solução salina na região branca da área teste e da área de controlo e emulsionar algumas colónias sugestivas de modo a obter uma suspensão ligeiramente opalescente e homogénea. De seguida, misturar a suspensão com o reagente látex desidratado até à completa reidratação e homogeneização sobre a área de reação. Proceder da mesma forma na área de controlo. Empreender movimentos circulares ao cartão, durante 1 minuto, e observar. A presença de aglutinação é indicativa da presença do antigénio. O teste é invalidado se ocorrer aglutinação na área de controlo, sendo indicativo de auto-aglutinação [142].
Sensibilidade: 97.9%; Especificidade: 93.2%
9.7. Identificação de Microrganismos e Teste de Suscetibilidade aos
Antimicrobianos
Equipamento: VITEK® 2, da bioMérieux
A identificação e TSA só devem ser realizados a partir de colónias isoladas em cultura pura.
Não é necessário proceder-se à identificação e TSA caso seja isolada a mesma espécie de microrganismo em amostras idênticas colhidas em dias sucessivos. No entanto, se a segunda amostra tiver vindo com um intervalo igual ou superior a 5 dias já será necessário, pois pode ter havido alterações na flora ou no padrão de suscetibilidade.
O VITEK® é um equipamento capaz de fazer a identificação de microrganismos de interesse e TSA. É constituído por uma estação de enchimento de cartas por vácuo, que força a suspensão da amostra a fluir para as cartas, uma zona de selagem, outra de incubação e leitura automática de cartas.
O reconhecimento das cartas de identificação e de TSA é feito através de uma unidade de leitura de códigos de barras. O software tem a capacidade de cruzar a informação da identificação com a do antibiograma e alerta caso o resultado do antibiograma não seja consistente com a bactéria identificada.
9.7.1. Preparação da Suspensão
O primeiro passo para se proceder à identificação de microrganismos e/ou TSA é preparar uma suspensão das colónias em estudo, em 3mL de solução salina, com a ajuda do densitómetro (Densichek). Para diferentes microrganismos, diferentes densidades são requeridas:
0.50-0.65 McFarland para a maioria das bactérias Gram positivo e Gram negativo;
1.8-2.20 McFarland para leveduras;
2.8-3.30 McFarland para Neisseria spp., grupo HACEK (Haemophilus spp.,
Aggregatibacter, actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens e Kingella kingae), anaeróbios e Corynebacterium spp.
Para cada ensaio faz-se um controlo da suspensão, inoculando 1µL em meio COS, permitindo manter a viabilidade do microrganismo, assim como averiguar a pureza da suspensão.
Depois de preparadas as suspensões, são acondicionadas numa rack que será programada no equipamento, em que é associado o número de cultura às cartas de identificação e/ou TSA.
9.7.2. Identificação de Microrganismos